氢磁共振定量法测定地氯雷他定片含量*

张雪晓，李阳杰，崔晓鸽，郑岩

(1.郑州澍青医学高等专科学校，郑州 450064；2.郑州工业应用技术学院，郑州 451150；3.上海医药工业研究院，上海 201203)

高强度磁场技术不断发展和傅里叶变换的应用，为磁共振技术应用于定量分析领域奠定了坚实的基础[1]。近年来《中华人民共和国药典》 《英国药典》《美国药典》《日本药局方》及《欧洲药典》等均收载了定量核磁技术。磁共振定量法(quantitative nuclear magnetic resonance，qNMR)应用最为广泛的是氢磁共振定量法(quantitative proton nuclear magnetic resona-nce，qHNMR)，其定量准确度可以接近高效液相色谱(HPLC)法水平[2-6]。含量测定大多采用内标法，即以结构和含量已知的化合物作为内标，与待分析成分配制成混合溶液进行同时测定，通过比较两者的积分面积确定待测成分的含量[6-8]。

地氯雷他定(desloratadine)化学名为8-氯-6，11-二氢-11-(4-哌啶烯基)-5H-苯并[5，6]环庚基[1，2-b]吡啶。地氯雷他定片主要用于缓解慢性特发性荨麻疹及常年性变应性鼻炎的全身及局部症状[9]。虽然国家药典委员会于2012年修订地氯雷他定片[标准号为WS1-(X-401)-2004Z]的国家标准，但2015年版《中华人民共和国药典》仍未收录该品种。修订版标准中地氯雷他定片的含量测定采用HPLC法，需要对其杂质进行分离，且引入校正因子后才能得出含量。鉴别采用HPLC法和紫外-可见分光光度法，操作过程较为繁琐，且各类试剂消耗量大，费时费力。因而建立一种简单、快速、准确的含量测定方法及鉴别方法显得意义重大。qNMR法是一种含量测定和鉴别、鉴定同时进行的分析方法，近年来越来越多地应用于药物分析领域。本研究采用1H-NMR法对地氯雷他定片进行鉴别、鉴定，qHNMR法测定地氯雷他定含量，为地氯雷他定片质量控制提供新的分析方法，也为qHNMR法进一步推广提供有价值的经验[5-6]。

1 仪器与试药

1.1仪器 400 MHz磁共振波谱仪(瑞士Bruker公司，型号：AvanceIII型)；高效液相色谱仪(安捷伦公司，型号：1200型，包括四元高压液相泵、自动进样器、DAD检测器)；电子分析天平(METTLER TOLEDO精密仪器有限公司，型号：AB265-S型，感量：0.01 mg)。

1.2试药 地氯雷他定片(上海先灵葆雅制药有限公司，批号：20170201，20170204和20170205)；地氯雷他定对照品(中国食品药品检定研究院，含量：99.6%，批号：100919-201402)；氘代三氯甲烷(CDCl3，美国Sigma公司)；1，2，4，5-四氯苯(美国Sigma公司，批号：34379)；磷酸二氢钾(国药化学试剂有限公司，批号：20161105)，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1测试条件 qHNMR法：采用zg30脉冲序列，测定温度为26.85 ℃，谱宽(SWH)为8012 Hz，采样时间(AQ)为4.01 s，弛豫时间(D1)为15 s，脉冲宽度(P1)9.54 s，样品扫描次数(NS)48次，空扫次数为2次。HPLC法：色谱柱为Agilent EXTEND RDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；检测波长为242 nm；流动相为甲醇-10 mmol·L-1磷酸二氢钾(45：55)；流速为1.0 mL·min-1；进样量为20 μL。

2.2内标、对照品与供试品溶液配制

2.2.1内标溶液与对照品溶液的配制 精密称取1，2，4，5-四氯苯100.0 mg于50 mL量瓶中，加入CDCl3，加热溶解后混匀，得浓度为2.0 mg·mL-1的内标溶液，密封后于冰箱保存。精密称取地氯雷他定对照品12.00 mg置于10 mL量瓶中，加入CDCl3，加热溶解后混匀，得浓度为1.2 mg·mL-1的对照品溶液，密封后置于冰箱保存。

2.2.2供试品溶液的配制 取地氯雷他定片15片，于研钵中研细。以地氯雷他定计，精密称取约10 mg，采用内标溶液定容至5 mL。取0.5 mL转移至5 mm核磁管中，待测。

2.31H-NMR鉴别 取片剂研磨后粉末适量，加入CDCl3后超声，测试1H-NMR(400MHz，CDCl3)。测试结果如下δ：8.33～8.44(m，1H)，7.41～7.48(d，1H)，7.13～7.30(t，3H)，7.01～7.22(t，1H)，3.31～3.64(t，2H)，3.01～3.15(m，2H)，2.76～2.91(m，2H)，2.61～2.35(m，3H)，2.35～2.51(m，1H)，1.40～1.91(br，1H)。1H-NMR谱的芳香区(δ7.22～7.44)显示了地氯雷他定结构中6个芳香氢信号。高场区(δ2.35～3.64)共显示12个质子峰，对应于结构中6个亚甲基(部分质子信号发生重叠)；δ：1.40～1.91为地氯雷他定结构式中-NH质子峰。综上所述，1H-NMR图谱与地氯雷他定分子式(C19H19ClN2)相符。

2.4qHNMR法测定地氯雷他定片含量

2.4.1专属性考察 取“2.2.2”项下配制的地氯雷他定与1，2，4，5-四氯苯混合溶液，获取1H-NMR，调整相位及基线后以CDCl3溶剂峰进行定标 。结果，1，2，4，5-四氯苯内标峰δ7.59与地氯雷他定的定量峰δ7.41～7.48完全分离，互不干扰。与未加内标的地氯雷他定1H-NMR相比较，加内标后1H-NMR谱中地氯雷他定各质子峰化学位移均未发生变化，表明内标物质1，2，4，5-四氯苯与地氯雷他定两者可稳定存在。

2.4.2方法学验证 qHNMR法测定药物含量时定量峰和内标峰积分范围的确定至关重要。选择目标峰进行积分时，应将峰谱图放大，且选取峰形轮廓线与水平基线重合处为其起止点，在此积分原则情况下进而进行方法学研究。

参考“2.2.1”项下配制方法，采用内标溶液配制质量浓度为1.84，3.69，6.08，9.37和11.86 mg·mL-1地氯雷他定一系列对照品溶液，转移0.5 mL至核磁管中，进样测定、获取各浓度的1H-NMR谱。地氯雷他定各浓度的1H-NMR谱调整相位及基线后，以地氯雷他定定量峰与内标峰峰面积之比为横坐标(X)，两者质量浓度比为纵坐标(Y)进行线性回归，得回归方程：Y=2.214 6X+0.100 8(r=0.999 3)。表明地氯雷他定在1.84～11.86 mg·mL-1的范围内，地氯雷他定定量峰峰面积与对应的质量浓度呈良好的线性关系。

取“2.2.2”项下供试品溶液，连续测定6次，以定量峰与内标峰面积比值为参考(AS/Ar)，并计算相对标准偏差(RSD)，结果显示RSD值为0.83%。取供试品溶液，分别于0，1，2，3，5 h进样测定。以定量峰与内标峰面积比值为参考(AS/Ar)，计算RSD值为1.42%，表明样品溶液在测试环境5 h内稳定。取地氯雷他定对照品溶液，逐步稀释。以信噪比(S/N)为10时，作为定量下限(LOQ)。以S/N值为3时，作为检出限(LOD)[8-9]。结果表明，LOQ为249.0 ng·mL-1，LOD为60.8 ng·mL-1。于地氯雷他定供试品溶液中分别加入低、中、高浓度地氯雷他定对照品，平行配制3份。按照“2.1”项下qHNMR方法进行测试并计算回收率，结果见表1。低、中、高浓度回收率98.80%～100.82%，平均回收率分别为101.61%，100.29%，99.75%，RSD分别为2.10%，1.52%，0.76%(n=3)。

表1 地氯雷他定的回收率实验结果

2.3质量平衡法与氢磁共振法测定结果 qNMR法计算公式为：Wu=WsAuEu/AsEs。式中：Wu为地氯雷他定质量(mg)；Au为地氯雷他定定量峰面积；As为内标峰面积；Ws为内标质量(mg)；Eu为地氯雷他定质子当量(地氯雷他定相对分子质量与定量峰代表的质子数之比)；Es为内标质子当量(内标相对分子质量与内标峰代表的质子数之比)。

取3批地氯雷他定片剂，分别采用HPLC法和qHNMR法测定地氯雷他定片中地氯雷他定的含量，结果见表2。可见HPLC法与qHNMR法测定结果基本一致。

表2 2种方法测定地氯雷他定片中地氯雷他定的含量比较

Tab.2Comparisonofdesloratadinecontentindicloratadinetabletsbytwomethods

mg/片

3 讨论

qHNMR法用于测定药物含量时，弛豫时间，采样次数等仪器参数对含量测定结果也有一定影响[3-6]。采集时间与图谱的分辨率有较大关系，若采集时间小于信号完全衰减成噪音时间，由于截尾效应会把假信号带入qHNMR图谱，从而导致图谱产生畸变。若采集时间大于信号完全衰减成噪音时间，则会增加测试时间。经考察，最终选用采集时间为4.01 s。弛豫时间和采样次数的确定是以定量峰和内标峰比值(Ax/As)趋于稳定时的初始值为参考，可以保证采用较短测试时间的情况下，提高qHNMR法准确性。分子结构中甲基、亚甲基、次甲基、芳香氢等质子的弛豫机制的不同，因而氢质子恢复Boltzmann 平衡程度不同。所以定量峰和内标峰应选择同一类型氢质子，提高qHNMR积分结果的一致性及准确性，本研究采用的定量峰和内标峰均为芳香质子。

采用qHNMR法测定药物含量时，内标物质对qHNMR分析测试的准确性也有很大影响[3-5，10]。前期对马来酸、1，2，4，5-四氯苯、富马酸二甲酯、对苯二甲酸二甲酯，苯甲酸卞酯等进行了考察。发现马来酸和1，2，4，5-四氯苯与地氯雷他定质子峰可完全分离。但地氯雷他定结构式中含2个N原子，呈一定的碱性；而马来酸结构式含2个-COOH，呈一定的酸性，为保证所选内标物质不与地氯雷他定发生反应，进而影响qHNMR测定结果，最终选用1，2，4，5-四氯苯作为内标物质，并进行一系列方法学验证。地氯雷他定含量测定结果显示，qHNMR法与HPLC法测定结果较为接近，但qHNMR法具有快速、简单、准确等优势，且可实现定性鉴别、鉴定和含量测定同步进行，为应用于药物的质量控制奠定了基础，有助于qHNMR法将来在药学研究领域发挥越来越重要的作用。