T-钙黏蛋白联合顺铂对顺铂耐药的黑色素瘤细胞的影响*

陆海涛，郭健，刘利君，牛艳东，段昕所

(承德医学院附属医院皮肤性病科，承德 067000)

皮肤黑色素瘤是一种高度恶性的肿瘤，源于外胚层神经嵴分化而来的黑素细胞，易转移，预后差[1]，目前的治疗效果欠佳[2]。顺铂(cisplatin，CDDP)是治疗多种肿瘤的一线用药，对于肿瘤细胞有明显的抑制作用[3]，但是在肿瘤化疗中出现的耐药现象[4-5]已明显削弱其疗效，解决抗肿瘤药物的耐药问题具有重大临床意义。肿瘤的基因治疗越来越受到关注，研究表明，T-钙黏蛋白(T-cadherin)可促进肿瘤细胞的凋亡[6]，降低肿瘤细胞的侵袭能力[7-8]。笔者拟建立对顺铂耐药的黑色素瘤细胞株(CDDP-R B16F10)，构建T-钙黏蛋白的真核表达载体，将T-钙黏蛋白基因转染黑色素瘤顺铂耐药株，观察T-钙黏蛋白联合顺铂对黑色素瘤顺铂耐药株的影响。

1 材料与方法

1.1材料 黑色素瘤B16F10细胞株由白求恩医科大学提供。顺铂(美国Sigma公司，批号：MKBV3446V，含量≥99.9%)，TRIzol：(美国Invitrogen公司，批号：15596026)，脂质体2000(LipofectamineTM2000，美国Invitrogen公司，批号：11668027)，噻唑蓝(MTT，美国Sigma 公司)，增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-N1，美国Invitrogen公司)，AMV反转录试剂盒(上海生工生物公司)，G418(Promega 公司)，免疫组化用T-钙黏蛋白一抗(美国Santa Cruz公司)，免疫组化用T-钙黏蛋白二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，碘化丙啶(propidium iodide，PI，美国Sigma公司)，DAB显色试剂盒(福州迈新生物技术有限公司)。

1.2CDDP-R B16F10的建立 采用大剂量冲击及逐步增加剂量相结合的方法诱导，使B16F10细胞能够在含有4 mg·L-1顺铂的RPMI-1640培养基中正常生长，命名为CDDP-R B16F10细胞。细胞计数法检测获得性耐药对肿瘤细胞增殖的影响，实验分2组，即CDDP-R B16F10细胞组和B16F10组(对照组)，肿瘤细胞接种于24孔板，每孔细胞数量为1×104个，每日计数 5 个孔的细胞，连续计数4 d后绘制生长曲线，根据 Patterson公式计算倍增时间。MTT法测定CDDP-R B16F10对顺铂的敏感性，实验分3组，分别为CDDP-R B16F10+CDDP组(培养基为含4 mg·L-1顺铂的RPMI-1640培养基)、B16F10+CDDP组(培养基为含4 mg·L-1顺铂的RPMI-1640培养基)、B16F10组(无顺铂，培养基为不含顺铂的正常RPMI-1640培养基)，细胞以2×105·mL-1的密度接种于96孔板，每孔加入细胞悬液100 μL，每日各组测定5个孔的吸光度(A)值，绘制生长曲线。

1.3T-钙黏蛋白真核表达载体的构建 据Gene Bank(NM_001257)设计2条引物，上游引物为5′-CCGGAATTCATGCAGCCGAGAACTCCGCT-3′，下游引物为5′-CGCGGATCCTCACAGACAAGCTAAGCTGAA-G-3′，下划线处分别为EcoR I和BamH I酶切位点，以TRIzol 一步法提取人子宫平滑肌组织的总RNA，经反转录、扩增、回收纯化后将其和pEGFP-N1用 EcoR I和BamH I分别进行双酶切，采用T4 DNA连接酶将目的基因片段连入线性化的pEGFP-N1真核表达载体中。转化感受态大肠埃希菌Top10，挑选单个阳性菌落接种于液体肉汤培养基，小量提取、限制性内切酶EcoR I和BamH I酶切鉴定，送检测序，证实pEGFP-N1-T-cadherin载体构建成功。

1.4T-钙黏蛋白转染CDDP-R B16F10细胞、筛选及鉴定 应用LipofectamineTM2000将pEGFP-N1-T-cadherin及pEGFP-N1空载体转染CDDP-R B16F10细胞，pEGFP-N1质粒携带G418抗性基因，G418进行筛选，2周后获得可稳定表达T-钙黏蛋白的CDDP-R B16F10细胞。采用有限稀释法挑选转染成功的单个细胞，反复筛选和传代，挑选在抗性培养基中生长良好的细胞作为稳定转染的细胞。将细胞分3组，分别为未转染基因的CDDP-R B16F10细胞，转染pEGFP-N1空载体的CDDP-R B16F10细胞和转染pEGFP-N1-T-cadherin 的CDDP-R B16F10细胞，采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(SP)法检测各组T-钙黏蛋白的表达情况。

1.5MTT法检测各组细胞的增殖情况 实验分6组，分别为CDDP-R B16F10组(空白对照组)、转染pEGFP-N1空载体的CDDP-R B16F10组(pEGFP-N1组)、转染pEGFP-N1-T-cadherin 的CDDP-R B16F10组(pEGFP-N1-T-cadherin组)、顺铂组、转染pEGFP-N1空载体联合顺铂的CDDP-R B16F10组(pEGFP-N1联合顺铂组)、转染pEGFP-N1-T-cadherin联合顺铂的CDDP-R B16F10组(pEGFP-N1-T-cadherin联合顺铂组)。空白对照组、pEGFP-N1组和pEGFP-N1-T-cadherin组的培养基为正常RPMI-1640培养基；顺铂组、pEGFP-N1联合顺铂组和pEGFP-N1-T-cadherin联合顺铂组的培养基为含4 mg·L-1CDDP的RPMI-1640培养基，采用MTT法，酶标仪波长490 nm处测各孔A值。

1.6流式细胞仪PI染色法检测各组细胞的凋亡情况 实验分组同前，取细胞2×106个，制成单细胞悬液，磷酸盐/柠檬酸盐作为缓冲液，PI染色，流式细胞仪上检测，观察凋亡峰情况。

2 结果

2.1CDDP-R B16F10的增殖能力及其对顺铂的敏感性 细胞计数法结果显示，在不含有顺铂的培养液中，CDDP-R B16F10和B16F10的增殖差异无统计学意义(P>0.05)，CDDP-R B16F10和B16F10的倍增时间分别为25.2和23.7 h(P>0.05)，结果见图1。MTT法结果显示，在含4 mg·L-1顺铂的培养基中，与B16F10+CDDP组比较，第1天CDDP-R B16F10+CDDP组的A值无显著改变(LSD-t=0.24，P>0.05)；第2，3，4天时，CDDP-R B16F10+CDDP组的A值均高于B16F10+CDDP组，差异有统计学意义(LSD-t=2.48，11.10，17.94，P<0.05)。结果还发现，同不含顺铂的正常培养基B16F10(无CDDP)组相比，含4 mg·L-1顺铂培养液培养的CDDP-R B16F10+CDDP组A值无显著改变，差异无统计学意义，结果见图2。

2.2转染后CDDP-R B16F10细胞T-钙黏蛋白的表达 转染24 h后，转染pEGFP-N1-T-cadherin和pEGFP-N1空载体的细胞均有绿色荧光表达。免疫组化SP法结果显示：转染pEGFP-N1-T-cadherin的CDDP-R B16F10细胞，T-钙黏蛋白呈阳性表达；其他两组呈阴性表达，见图3。

图1 获得性耐药对肿瘤细胞增殖的影响

Fig.1Theeffectofacquieddrug-resistanceontheproliferationoftumorcells

图2 CDDP-R B16F10对顺铂的敏感性

Fig.2ThesensitivityofCDDP-RB16F10tocisplatin

2.3T-钙黏蛋白联合顺铂对CDDP-R B16F10细胞增殖的影响 T-钙黏蛋白联合顺铂可抑制耐药细胞的增殖(P<0.05)，结果见表1。

2.4T-钙黏蛋白联合顺铂对CDDP-R B16F10细胞凋亡的影响 空白对照组、pEGFP-N1组、pEGFP-N1-T-cadherin组、顺铂组、pEGFP-N1联合顺铂组、pEGFP-N1-T-cadherin联合顺铂组的凋亡率分别为(0.74±0.21)%，(0.58±0.37)%，(6.23±1.70)%，(0.67±0.38)%，(0.72±0.30)%，(19.43±2.52)%。pEGFP-N1-T-cadherin联合顺铂组的凋亡率明显高于其他各组(F=105.991，P<0.05)。pEGFP-N1-T-cadherin联合顺铂组可见明显的亚倍体峰，T-钙黏蛋白联合顺铂可促进CDDP-R B16F10的凋亡(P<0.05)，见图4。

3 讨论

黑色素瘤是皮肤癌中侵袭性最强的类型，其最突出的特点是对放疗、化疗的不敏感以及外部刺激可促进肿瘤的进展和转移。顺铂是一种细胞周期非特异性细胞毒性药物，作为传统的抗肿瘤药，顺铂已出现耐药现象。目前认为，药物去活作用增强，DNA损伤修复异常，药物摄取异常，细胞凋亡通路及一些间接信号通路的变化等可能与顺铂耐药有关。钙黏蛋白作为黏附分子中一个超家族，可介导钙依赖的细胞间黏附，在多种肿瘤的增殖、迁移过程中起重要的作用，上调某些钙黏蛋白分子可提高肿瘤对化疗药物的敏感性[9]。T-钙黏蛋白分子属于钙黏蛋白超家族，因其缺少跨膜区而以糖基磷脂酰肌醇分子在细胞膜上附着而得名。研究表明，T-钙黏蛋白可抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞的凋亡[10]，已在人类多种恶性肿瘤中检测到T-钙黏蛋白的表达缺失[11-13]。

本研究首先建立黑素瘤顺铂耐药株(CDDP-R B16F10)，然后检测了CDDP-R B16F10的增殖能力，结果显示获得性耐药不影响肿瘤细胞的增殖速度。进一步采用MTT法检测CDDP-R B16F10对顺铂的敏感性，在含4 mg·L-1顺铂的培养基中，第2，3，4天时CDDP-R B16F10细胞的A值高于B16F10细胞，说明CDDP-R B16F10细胞对顺铂的敏感性低于B16F10细胞，获得了对顺铂的耐药性。采用脂质体转染的方法将构建的T-钙黏蛋白质粒转染CDDP-R B16F10，发现T-钙黏蛋白联合顺铂可抑制耐药肿瘤细胞的增殖，促进其凋亡。

A.未转染质粒的细胞，T-钙黏蛋白呈阴性表达；B.转染pEGFP-N1空载体的细胞，T-钙黏蛋白呈阴性表达；C.转染pEGFP-N1-T-cadherin的细胞，T-钙黏蛋白呈阳性表达。

图3 免疫组化SP法检测转染后T-钙黏蛋白的表达(×200)

A.The negative expression of T-cadherin in un-transfected cells；B.The negative expression of T-cadherin in blank vector transfectants；C.The positive expression of T-cadherin in pEGFP-N1-T-cadherin cells.

Fig.3T-cadherinexpressiondetectededbySPimmunohistochemistryaftertransfection(×200)

表1 T-钙黏蛋白联合顺铂对CDDP-R B16F10细胞增殖的影响

组别A值抑制率/%空白对照组1.17±0.09①-pEGFP-N1组1.22±0.13①-pEGFP-N1-T-cadherin组0.88±0.09①24.8顺铂组1.23±0.08①-pEGFP-N1联合顺铂组1.15±0.07①-pEGFP-N1-T-cadherin联合顺铂组0.45±0.1161.5F57.732P<0.05

①与pEGFP-N1-T-cadherin联合顺铂组比较，P<0.05。

①Compared with pEGFP-N1-T-cadherin combined with cisplatin group，P<0.05.

Bcl-2家族蛋白是调控细胞凋亡的主要调节蛋白。研究表明，上调Bcl-2可提高肿瘤的耐药性[14]，刘贤奎等[15]将Bcl-2基因转染膀胱癌细胞后，发现Bcl-2的高表达可导致肿瘤多药耐药性，Bcl-2可导致顺铂耐药性的产生[16]。研究发现，钙黏蛋白可负向调节Bcl-2的表达[17]，作为钙黏蛋白超家族的一员，T-钙黏蛋白分子亦可下调Bcl-2的表达[6]。将T-钙黏蛋白转染黑色素瘤顺铂耐药细胞株后，可能通过调控Bcl-2的表达，从而实现顺铂耐药性的逆转。

T-钙黏蛋白可拮抗PI3K/Akt信号通路[6]。PI3K/Akt通路是经典的抑制细胞凋亡的信号通路之一，该信号通路的异常也参与顺铂的耐药[18]，可通过补偿顺铂引发的致死信号从而抑制细胞凋亡[19]。p-Akt1在顺铂耐药的肿瘤组织中呈高表达，Akt1的扩增可通过mTOR/ p70s6k通路发挥诱导肿瘤细胞株对顺铂的耐药作用[20]。笔者推测，T-钙黏蛋白在CDDP-R B16F10的重新表达，可能通过该通路导致顺铂耐药，也可能同通过该通路下游底物及效应因子如Bcl-2、survivin、CSE等[21]，最终逆转了耐药细胞株对顺铂的耐药性。

A.空白对照组；B.pEGFP-N1组；C.pEGFP-N1-T-cadherin组；D.顺铂组；E.pEGFP-N1联合顺铂组；F.pEGFP-N1-T-cadherin联合顺铂组。

图4 6组细胞的凋亡峰

A.Blank control group；B.pEGFP-N1 group；C.pEGFP-N1-T-cadherin group；D.Cisplatin group;E.pEGFP-N1 combined with cisplatin group;4F.pEGFP-N1-T-cadherin combined with cisplatin group.

Fig.4Apoptoticpeakinsixgroupsofcells

综上所述，肿瘤细胞获得顺铂耐药性的途径是多方面的，且十分复杂。T-钙黏蛋白可能同时针对多种不同的耐药机制，最终实现顺铂耐药性的逆转。T-钙黏蛋白逆转肿瘤耐药性的具体机制，以及T-钙黏蛋白联合顺铂后所表现出的抗肿瘤作用，有待进一步研究。