RNA结合蛋白作为氯福克酚药靶的机制初探

张美莲，王志星，胡 艳，冉坤念，韩 为*，彭小忠,2*

(1.中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 医学分子生物学国家重点实验室生物化学与分子生物学系 医学灵长类研究中心 神经科学中心，北京 100005；2.中国医学科学院医学生物学研究所，云南 昆明 650118)

恶性神经胶质瘤(glioma)是最常见且极具致命性的颅内肿瘤[1]，目前除替莫唑胺以外，缺少其他有效治疗胶质瘤的药物[2]。而胶质瘤干细胞对胶质瘤的发生发展以及放化疗抵抗有关[3-4]，故筛选能够有效且特异性抑制胶质瘤干细胞(glioma stem cell，GSC)的药物对胶质瘤的治疗至关重要。

本实验室前期通过药物筛选，发现了一种可有效抑制GSC的小分子药物氯福克酚(clofoctol)，并通过依赖于靶点稳定性的药物亲和反应(drug affinity responsive target stability，DARTS)技术找寻到了该药物的作用靶点，一种RNA结合蛋白(RNA-binding protein，RBP)N-ras上游蛋白(upstream of N-ras，UNR)，氯福克酚可通过与UNR的结合而上调凋亡相关因子Krüppel样因子13(krüppel-like factor 13，KLF13)的表达，进而诱导胶质瘤干细胞的凋亡，从而起到治疗胶质瘤的效果[5]。但氯福克酚与其靶点UNR结合后是如何上调KLF13的表达，以及氯福克酚抗胶质瘤的其他作用途径尚不清楚，本研究旨在进一步探索氯福克酚抗胶质瘤的机制，从而为氯福克酚用于胶质瘤的靶向治疗提供更多依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系：人神经胶质瘤细胞系(LN229)(ATCC公司)。

1.1.2 主要试剂：UNR抗体(ABclonal Biotechnology公司)；氯福克酚(MicroSource Discovery公司)；Streptavidin Sepharose 珠子(GE公司)；体外转录试剂盒、NE-PER试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)；基因芯片(CapitalBio公司)。

1.2 方法

1.2.1 Biotin pull-down实验：为探究UNR与KLF13mRNA的互作，以及氯福克酚对二者互作能力的影响，实施pull-down实验检测。参考实验室前期生物信息学预测的KLF13mRNA上潜在的UNR结合位点[5]，设计并制备200～300 bp长度的生物素标记的6条探针。采用核质分离(NE-PER)试剂盒，根据说明书分别提取未处理、DMSO、10 μmol/L和1 mmol/L氯福克酚处理的LN229细胞总蛋白，体外进行探针与细胞总蛋白的孵育，streptavidin sepharose珠子与混合物结合、洗杂、收集与探针结合的蛋白样品并进行Western blot检测与探针结合UNR的含量。

1.2.2 氯福克酚DARTS样品质谱检测结果与转录组学芯片联合分析：为分析氯福克酚在胶质瘤中的其他作用靶点以及对其他下游靶基因的预测，做联合分析。氯福克酚DARTS样品质谱结果与转录组学芯片分析使用Cytoscape软件(version 3.7.1，Affymetrix公司)分析。首先，对3 μmol/L和10 μmol/L氯福克酚处理GSC后上下调差异明显的基因取交集，满足foldchange>2且P<0.05，筛选在GSC中受氯福克酚所调控的下游差异表达基因。其次，分析氯福克酚DARTS样品质谱结果，关注氯福克酚作用的经典RBP(RNA-binding protein)，满足foldchange>5且P值<0.05，人类RBP数据来自EuRBPDB数据库[6]。再次，分别对氯福克酚作用的经典RBP所直接结合的RNA或调控的下游靶基因与氯福克酚转录组差异基因取交集，其中人类UNR iCLIP数据来自L.；人类真核翻译起始因子3B(eukaryotic translation initiation factor 3 subunit B，EIF3B)PAR-CLIP数据来自CLIPdb数据库[7]；输出蛋白7(exportin 7，XPO7)所调控的基因来自小鼠敲低后的芯片数据[8]，并利用UniProt网站对涉及的基因进行人同源覆盖度分析；受亮氨酰tRNA合成酶(leucyl-tRNA synthetase，LARS)所主要调控的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信号通路基因集来自KEGG数据库。最后，分析氯福克酚转录组芯片与基因表达水平对患者预后的影响，预测氯福克酚作用于经典RBP的其他下游靶基因，患者基因表达水平与预后相关性数据来自基因表达谱数据动态分析(gene expression profiling interactive analysis，GEPIA)数据库。

1.3 统计学分析

使用Cytoscape (version 3.7.1) 软件进行多组学数据分析。

2 结果

2.1 氯福克酚可增强UNR与KLF13 mRNA之间的互作

针对KLF13mRNA的CDS区和3′UTR区制备的6条生物素探针中(图1A)，与其他几条探针相比，3#和6#探针与UNR之间存在明显的结合(图1B)。并且相对于DMSO组，10 μmol/L和1 mmol/L氯福克酚(clofoctol)处理均可增强3#探针与UNR的结合(图1C)。

2.2 氯福克酚作用于UNR的下游靶基因预测分析

3 μmol/L和10 μmol/L的氯福克酚处理胶质瘤干细胞后的这两个芯片数据取交集，得到了249个上下调差异表达明显的基因(图2A)。对药靶UNR的iCLIP-seq基因集，与这249个差异基因取交集，筛选出了11个氯福克酚作用于UNR的下游靶基因(图2B)。在氯福克酚治疗后表达上调的5个基因中，RPL6、LDHB和ATP6V0D1这3个基因的高表达与胶质瘤患者较好的预后相关，而在表达下调的6个基因中，CDH24和SRP7这2个基因的低表达也与胶质瘤患者较好的预后相关(图2B,C)。

2.3 氯福克酚可作用于经典RNA结合蛋白

氯福克酚除作用于UNR以外，还可作用于另外3个经典RNA结合蛋白XPO7、LARS和EIF3B(图3A)。在小鼠中敲低XPO7后所调控的基因中有85个人同源基因，这85个基因与249个差异基因取交集，得到1个基因CACNA1S(图3B,C)。由LARS所主要调控的mTOR信号通路基因集与249个差异基因取交集，得到AKT2和RPS6KB2这2个基因。EIF3B PAR-CLIP基因集与249个差异基因取交集，得到64个基因。

2.4 氯福克酚可作用于其他经典RBP的下游靶基因预测分析

在上述筛选得到的3个可能的下游靶基因CACNA1S、AKT2和RPS6KB2中，存在1个基因RPS6KB2的低表达与胶质瘤患者较好的预后相关，这与氯福克酚治疗可下调其表达的结果一致(图4A)。EIF3BPAR-CLIP基因集与249个差异基因取交集得到的64个基因，主要富集在由肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL) 所激活的凋亡信号通路上(图4B)。

A.schematic of the 6 indicated candidate biotin-labeled probes ofKLF13mRNA; B.biotin pull-down assay analysis of the binding between UNR and probes ofKLF13mRNA,PABPC1 was the positive control, the results showed there had a binding between 3# and 6# probes withKLF13mRNA; C.clofoctol treatment (10 μmol/L) 1 hour at 37 ℃invivoand treatment (1 mmol/L) 1 hour at 25 ℃invitroall increased the binding between UNR andKLF13mRNA-3# probes, but notKLF13mRNA-6# probes

图1 氯福克酚增强UNR与KLF13mRNA之间的互作
Fig 1 Clofoctol enhanced the interaction between UNR andKLF13mRNA

A.Venn diagram depicting the overlap of genes regulated by clofoctol-treated with 3 μmol/L and 10 μmol/L, as determined by microarray data,foldchange>2,P<0.05; B.Venn diagram depicting the overlap of genes regulated by clofoctol at the steady-state level and UNR iCLIP targets,foldchange>2,P<0.05; C.high expression ofRPL6, andLDHBcorrelated with great survival of patients and low expression ofCABLES1andSRP72correlated with great survival of patients by analyzing information fromGEPIAwebsite,P<0.05

图2 氯福克酚作用于UNR的下游靶基因预测分析
Fig 2 Prediction analysis of the downstream target genes of clofoctol on UNR

3 讨论

RNA结合蛋白(RBP)通过调控RNA从而发挥特定的生物学功能。RBP可通过影响癌细胞凋亡、侵袭与转移等过程，而参与恶性胶质瘤的发生与发展[9-10]，因此可以通过改变RBP自身的表达水平或者影响RBP与RNA的相互作用，以期实现肿瘤的靶向治疗[11]，然而以RBP为靶点来治疗胶质瘤的研究尚少。

本实验室前期筛选出了一种以RNA结合蛋白UNR为靶点的可有效治疗胶质瘤的潜在新药氯福克酚，但药靶UNR调控靶基因KLF13表达的具体机制尚不清楚。为了证明靶基因KLF13mRNA与药靶UNR之间存在互作，克隆并制备了包含UNR潜在结合位点的6条探针，体外pull-down筛选到了2条包含GAAGGA、GAAGAA序列的KLF13mRNA所在探针片段可结合UNR，利用pull-down实验进一步发现氯福克酚处理可增强其中一条探针与UNR的结合能力，这提示氯福克酚可能主要通过该探针所在片段，增强UNR与KLF13mRNA的结合能力。为了找寻氯福克酚抗胶质瘤的其他重要作用靶点以及下游途径，通过氯福克酚DARTS样品质谱检测结果结合转录组芯片分析，发现除了UNR蛋白外，另外3个经典RNA结合蛋白XPO7、LARS和EIF3B也可以作为氯福克酚的靶点，这4个RBP均具有可结合RNA的保守结构域[6]。利用网上已公开的数据进一步预测分析发现，氯福克酚还可能通过调控mTOR信号通路以及TRAIL激活的凋亡信号通路而起到抗胶质瘤的效果，但氯福克酚治疗胶质瘤的这些潜在机制还尚未进一步证实。

A.summary of canonical RBP, non-canonical RBP, and non-RBP for clofoctol DARTS,foldchange>5,P<0.05; B.venn diagram depicting the homologous coverage of XPO7 by human and mouse; C-E.Venn diagram depicting the overlap of genes regulated by clofoctol at the steady-state level and XPO7-regulated targets, LARS-regulated mTOR pathway targets, and EIF3B PAR-CLIP targets,foldchange>2,P<0.05

图3 氯福克酚作用于经典RBP
Fig 3 Clofoctol acted on canonical RNA-binding proteins

A.low expression ofRPS6KB2correlated with great survival of patients by analyzing information fromGEPIAwebsite, butAKT2not,P<0.05; B.GO analysis of64genes

图4 氯福克酚作用于其他经典RBPs的下游靶基因预测分析
Fig 4 Prediction analysis of downstream target genes of clofoctol on other canonical RBPs

总之，本研究证实了氯福克酚通过药靶UNR治疗胶质瘤的机制，并另外发现了3个氯福克酚的RNA结合蛋白潜在药靶，并分析预测到了一些其他下游靶基因，这为氯福克酚可作为治疗恶性胶质瘤的潜在新药提供了强有力的证据支持。