糖尿病模型兔眼结膜损伤的病理机制研究

葛 健, 朱彩红, 吴彦霖, 吴永杰

(1.上海交通大学医学院附属瑞金医院眼科, 上海200025;2.上海交通大学医学院附属瑞金医院, 上海市高血压研究所,上海市高血压重点实验室, 上海200025)

糖尿病患者角膜知觉减退，可能是糖尿病患者的感觉神经病变引起的; 糖尿病患者角膜的愈合能力下降，角膜上皮易出现点状上皮的缺损; 同时基础泪液的分泌量减少，更易出现结膜和角膜表面的干燥; 从而使眼表微环境发生变化，损害眼表组织[1-2]。本实验应用人工诱导的糖尿病兔模型来检测其结膜的基质金属蛋白酶(MMPs)和基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)的表达，结合结膜的病理检查探讨糖尿病兔眼表微环境改变的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

普通级雄性日本大耳白兔20只, 8周龄, 体质量2.66 ～3.44 kg, 由上海斯莱克实验动物有限公司提供[SCXK沪2017-0005] 。20只兔随机分成2组,每组10只。对照组全程给予兔专用配合普通饲料喂养; 实验组给予高脂高糖饲料(普通基础饲料53%，猪油10%，蔗糖37%)喂养8 周后，以2%链脲佐菌素制备糖尿病模型。兔饲养于上海交通大学医学院实验动物科学部[SYXK沪2018-0027]。

1.2 主要试剂和仪器

MMPs 和TIMPs 的ELISA试剂盒购自上海明睿生物有限公司。成纤维细胞生长添加剂(FGS)购自北京裕恒丰生物科技有限公司。DMEM培养基和胰蛋白酶溶液均购自上海博谷生物科技有限公司。多克隆抗兔一抗试剂盒购自北京博奥申生物工程有限公司。多克隆抗兔二抗二步法检测试剂盒和DAB显色试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司。ELX808 酶标仪购自美国Bio-Tec 公司；Moti-cam3000 显微摄影成像系统购自美国Motic 公司；倒置显微镜购自日本Olympus 公司。

1.3 糖尿病模型的制备[3]

高脂高糖饲料喂养8周的实验组兔10只，进行口服糖耐量试验及胰岛素释放试验，对出现胰岛素抵抗的兔禁食12 h。以3%戊巴比妥钠按30 mL/kg 体质量麻醉后，经耳缘静脉注射现配2%链脲佐菌素溶液(65 mL/kg 体质量)，72 h 后再次注射同等剂量链脲佐菌素溶液。每2 周测1 次空腹血糖，连续2 次血糖高于11.0 mmol/L 视为造模成功。本研究中糖尿病实验组最终造模成功9 只。造模成功后的糖尿病实验组兔与正常对照组一样喂以专用配合普通饲料。

1.4 组织取材及处理

实验组造模成功后2周，2组兔以3%戊巴比妥钠(30 mL/kg 体质量)麻醉后，逐一将每只兔的双眼经消毒铺巾后，每一眼球取结膜2 mm×3 mm 组织，缝合结膜伤口。同时将左眼球结膜剪成2 片1 mm×3 mm 大小，置于4 ℃冰箱保存；右眼球结膜组织置于体积分数10%中性甲醛溶液中备用。结膜组织解剖上可分为球结膜和睑结膜，球结膜便于手术取材，本实验所取结膜均为兔球结膜组织。

1.5 球结膜组织的病理检查

将2组兔右球结膜组织19份在体积分数10%中性甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片，HE 染色后，在光学显微镜下观察记录。

1.6 免疫组织化学法测定球结膜的MMP-1、MMP-3 和MMP-9

将2 组19 份兔左球结膜组织经切片常规脱蜡，在3%H2O2中孵育10 min，用PBS 冲洗2 min共3 次; 将切片放入枸橼酸盐缓冲液(pH=6)，微波炉中加热5 min 共2 次，间隔10 min，冷却至室温；滴加一抗，4 ℃冰箱放置10 h，PBS冲洗2 min共3 次,再滴加二抗，37 ℃孵育30 min，冲洗2 min 共3 次；DBA 显色5～10 min，蒸馏水充分冲洗，再用苏木精复染1 min，常规脱水至透明，中性胶封片。最后用Motic3000 显微摄影系统在400 倍下摄片，采用Image-pro plus6.0病理图像分析系统对阳性表达进行定量分析，以积分吸光度代表蛋白相对的表达量，记录列表。,

1.7 ELISA法检测球结膜组织细胞培养上清液中TIMP-1 和TIMP-3[4-5]

将2组19份左眼球结膜组织经清洗干净，修剪组织小于1 mm2后，放入6 孔板中，在CO2培养箱中待干，以后将板翻转后浸入4 mL 含青霉素-链霉素，10%胎牛血清和0.1%FGS的DMEM培养液中。每2 日换培养液1 次；同时用倒置显微镜观察细胞形态，用免疫荧光法对成纤维细胞的特异性蛋白进行检测，以此鉴别成纤维细胞。然后选取4～6 代呈对数生长期的细胞，把生长至90%的细胞消化后，用含10%胎牛血清的培养液配成细胞悬液；再以3×105个/mL 细胞密度接种在24 孔板上，每孔注液1 mL。培养24 h 后，更换无血清的DMEM 培养液，每孔1 mL，置于含5% CO2培养箱中继续培养，48 h 后收集各孔的培养液，经高速离心机以800 r/min 离心25 min；取上清液放入无菌EP管中，分装置-20 ℃冷冻保存。最后用试剂ELISA 盒，在酶标仪的450 nm波长检测各孔的吸光度(A)值; 利用标准品的A 值和其相对应的质量浓度，以A 值为横坐标，质量浓度为纵坐标，把样本的A 值代入计算得相应的样本质量浓度(ng/mL)，记录列表。

1.8 实验数据分析

采用统计软件SPSS 23.0 对数据进行统计学分析处理，计量资料以表示；组间比较采用配对t 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织学观察

糖尿病实验组中可见眼结膜上皮排列整齐，上皮下组织明显减少，结膜组织疏松，可见萎缩的筋膜组织，结膜固有层细胞松散，且细胞间炎性细胞增多，甚至出现多量的炎性细胞局灶状聚集，少见有弹力纤维 (图A)。正常对照组可见结膜上皮层排列整齐，上皮层下组织致密且组织层次清晰，结膜组织细胞间炎性细胞少见(图B)。

图1 兔球结膜组织学观察

2.2 MMPs表达

对照组10 只兔球结膜的MMP-1、MMP-3 和MMP-9 表达值分别为(465.32± 76.78) ng/mL、(687.15±82.34) ng/mL 和(697.45±89.56) ng/mL;实验组9 只兔球结膜MMP-1、MMP-3 和MMP-9 表达值分别为(1 565.48± 98.78) ng/mL、(1 789.45±90.26) ng/mL 和(1 679.35± 103.12) ng/mL，实验组兔球结膜的MMPs 表达明显高于对照组(P<0.05)。

2.3 TIMPs 表达

对照组10只兔球结膜TIMP-1 和TIMP-3含量分别为(0.53±0.01) ng/mL 和(0.23 ± 0.01) ng/mL;实验组9 只兔球结膜细胞TIMP-1 和TIMP-3 含量分别为(0.65±0.01) ng/mL 和(0.13 ± 0.01) ng/mL。

TIMP-1 的表达略高于对照组，但组间差异无统计学意义(P>0.05)。TIMP-3 的表达实验组明显低于对照组(P<0.05)。

3 讨论

糖尿病以高血糖为最主要临床表现，高血糖可以使组织细胞分泌的细胞因子发生改变，从而改变细胞代谢, 使细胞的原有功能发生改变[6-8]。高血糖可以使眼表的角膜知觉度降低，眼表的泪湖高度减低。本实验主要观察了高血糖和球结膜MMPs 和TIMPs 表达间的关系，进一步从球结膜病理上说明了球结膜MMPs 和 TIMPs的表达和糖尿病实验组兔结膜的损害之间的联系。

MMP-1 主要水解纤维类的胶原，MMP-3 能溶解蛋白多糖、纤连蛋白、弹性蛋白等多种胶原蛋白。高血糖也能促进结膜MMP-3 和MMP-9 的高表达[9-10]。MMP-9 有明胶酶活性，可水解变性的胶原和Ⅳ、Ⅴ型胶原蛋白[11]。

糖尿病实验组的兔球结膜MMP-1、MMP-3和MMP-9 都高于对照组，说明这些胶原酶释放出成纤维细胞较多，使原细胞内储存减少。球结膜TIMP-1 和TIMP-2 具有抑制MMP-1、MMP-3和 MMP-9 的活性作用，正常结膜组织的弹性和组织形态的维护需要MMP-1/TIMP-1 平衡处于正常状态。但糖尿病实验组球结膜TIMP-1的表达与正常对照组的表达差异无统计学意义，说明MMP-1/TIMP-1 的平衡被破坏。另外，糖尿病实验组兔球结膜TIMP-3 的表达明显低于正常对照组，说明释放到成纤维细胞外的胶原酶减少了，MMP-3/TIMP-3 的平衡也被破坏[12]。这些MMPs/TIMPs 失衡过程使球结膜下组织，眼筋膜组织产生过度的降解，造成结膜组织的损害，从而临床上出现结膜松弛[13]; 结膜松弛可造成泪液膜的不稳定，也造成了泪湖的实际容积量减少，从而使角膜结膜组织表面出现干糙，结膜上皮出现易损现象。结膜角膜组织的干燥、泪液膜的不稳定和结膜松弛都会进一步促进结膜和角膜的炎症发生。本实验中实验组兔结膜在光镜下可以观察到结膜上皮下组织明显减少、结膜组织疏松、筋膜组织萎缩、结膜固有层细胞松散，且细胞间炎性细胞增多。

本实验中实验组兔结膜实验取材时并没有出现结膜炎症的表现，但是病理上证实有不同程度的炎性细胞浸润，这与Ward 等[14]的发现有异，然而作者认为早期的炎性细胞浸润程度可能和MMP-9 的表达程度有关，也可认为是早期的炎性细胞变化促进了MMPs 的表达，从而更促进了后期球结膜下组织和眼筋膜组织的降解过程。高血糖促进了兔结膜MMPs 的表达，促进实验兔的结膜和眼筋膜出现弹力纤维的减少，结膜上皮下组织疏松，结膜松弛；从而改变了糖尿病兔的眼表微环境，出现结膜角膜的干糙和角膜结膜组织的损害。