低氧预适应对氧糖剥夺/复糖复氧损伤的BV2细胞的保护作用及对其NLRP3表达的影响

陈宇庞一强

(1. 包头医学院基础医学与法医学院，内蒙古 包头 014040；2. 包头医学院研究生学院，内蒙古 包头 014040；3. 内蒙古包头市第四医院，内蒙古 包头 014030)

近年来，我国卒中疾病负担日趋加重，统计数据显示，2014年我国脑卒中死亡率达153.61/10万人，我国卒中死亡人数占全球的29.4%。脑卒中分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中缺血性脑卒中最为多见[1]。目前救治急性缺血性脑卒中患者最有效的手段是尽早通过血管内介入取栓或药物溶栓，使阻塞血管再通，恢复脑组织血液循环，但部分患者随着血管再通却引起了缺血区的二次损伤即脑缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion，I/R)损伤[2]。I/R脑损伤是多因素参与的极其复杂的机制，近年来越来越多的研究表明，炎症反应与I/R脑损伤密切相关[3-5]，小胶质细胞作为中枢神经系统的常驻免疫细胞，约占健康哺乳动物大脑细胞总数的10%，作为单核-巨噬细胞家族的成员，是神经炎症的主要效应细胞之一，具有识别和清除死亡细胞、病原体和一些内源性化合物和外源化合物的作用[6]。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎症体作为研究最广泛的炎症体，存在于中枢神经系统的小胶质细胞和星形胶质细胞中[7]。最近的研究结果表明，NLRP3炎症小体介导的炎症反应在缺血性缺血再灌注损伤中发挥着重要的作用，抑制NLRP3炎症小体可对缺血性脑卒中缺血再灌注损伤发挥保护作用[8]，因此，NLRP3炎症信号可能是缺血性脑卒中治疗的一个潜在的治疗靶点。低氧预适应(Hypoxia preconditioning，HPC)是指生物体、系统、器官、组织或细胞暴露于亚致死性低氧/缺血中，导致对随后发生的严重缺氧/缺血的抵抗力增强的现象[9]。有研究表明[10]，低氧预适应可以明显减小缺血性脑卒中的梗塞面积，对缺血性脑卒中起到神经保护作用。本文则利用小鼠小胶质细胞系BV2细胞，利用体外氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)培养，模拟体内缺血性脑卒中缺血再灌注损伤过程，观察低氧预适应是否可以对缺血性脑卒中缺血再灌注损伤起到保护作用，并观察低氧预适应对其NLRP3蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 BV2细胞(小鼠小胶质细胞系，上海拜力生物公司)；DMEM(高糖)培养基(美国Gibco公司)；DMEM(无糖)培养液基(美国Gibco公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；青链霉素(美国Gibco公司)；MTS活细胞数量检测试剂盒(美国Promega公司)；RIPA裂解液(中国Beyotime公司)；BCA法蛋白定量试剂盒(美国Thermo公司)；兔源抗NLRP3抗体(美国CST公司)；鼠源抗β-actin单克隆抗体(美国Santa cruz公司)；驴抗兔HRP结合二抗(中国Bioss公司)，山羊抗鼠HRP结合二抗(中国中杉金桥公司)；超敏ECL化学发光试剂(中国Applygen公司)。其余试剂均为国产试剂。

1.2 方法

1.2.1 BV2细胞的OGD/R培养 常规复苏BV2细胞，用含10%胎牛血清的DMEM(高糖)培养基培养至基本融合并铺满瓶底80%～90%后，将原培养液倒出，用 PBS 清洗细胞3次，BV2细胞按一定密度接种于96孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM(高糖)培养基培养24 h后，弃培养基，用无糖、无血清的DMEM 培养基更换，置于含37℃，1%O2、94%N2、5% CO2的三气培养箱中培养。分别进行低氧培养1 h、2 h、3 h、4 h，然后进行复氧，即将细胞置于二氧化碳培养箱中常规培养(37℃，95%空气，5% CO2)2 h，应用MTS法测定细胞活力，选择细胞活力最低的一组作为OGD/R模型。

1.2.2 HPC对BV2细胞OGD/R培养细胞活力的影响 BV2细胞按一定密度接种于96孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM(高糖)培养基培养24 h后，进行低氧预适应处理，低氧预适应条件为：A:1%O2低氧30 min/复氧30 min×4次；B: 1%O2低氧2 h/复氧2 h；C: 1%O2低氧30 min/复氧30 min×2次； D: 1%O2低氧1 h/复氧1 h；之后立即进行OGD/R，应用MTS法测定细胞活力，选择细胞活力最高的一组作为HPC+OGD/R模型。

1.2.3 蛋白免疫印迹检测不同处理组BV2细胞NLRP3表达的变化 BV2细胞分为4组，分别为常氧(Normoxia，N)组，HPC组，HPC+OGD/R组，OGD/R组，按一定密度接种于100 mm培养皿中，用含10%胎牛血清的DMEM(高糖)培养基培养至细胞铺满培养皿底80%左右，常氧组继续置于二氧化碳培养箱中常规培养(37℃，95%空气，5% CO2)，其余三组按照各组条件进行培养，处理结束后收集各组培养皿中细胞，按照文献[11]方法用加有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液辅助超声波破碎仪将细胞进行裂解提取全细胞裂解液，并用BCA法测定各组蛋白质含量，各组样品以20 μg进行蛋白免疫印迹实验，检测NLRP3表达的变化。

2 结果

2.1 不同OGD培养时间后OGD/R BV2细胞的细胞活力 与常氧(N)组比较，OGD 1 h、2 h、3 h、4 h后复氧2 h，BV2细胞活力逐渐降低，至OGD 3 h/R 2 h时，细胞活力降至最低(P<0.05)，OGD 4 h/R 2 h与OGD 3 h/R 2 h细胞活力比较差异不大(P>0.05)，故实验选择OGD 3h/R 2 h作为体外模拟脑缺血再灌注(OGD/R)模型，见图1。

注：与N组比较，*P<0.05；OGD 1 h与OGD 2 h比较，#P<0.05；OGD 2 h与OGD 3 h比较，$P<0.05

2.2 不同HPC条件处理后进行OGD 3 h/R 2 h处理的BV2细胞活力 将BV2细胞分为4个不同HPC条件处理组，分别为A：1%O2低氧30 min/复氧30 min×4次；B：1%O2低氧2 h/复氧2 h；C：1%O2低氧30 min /复氧30 min×2次；D：1%O2低氧1 h/复氧1 h。与对照组(OGD 3 h/R 2 h)比较，4个HPC条件中，1%O2低氧2 h/复氧2 h+ OGD 3 h/R 2 h细胞活力最高，故后续实验选择1%O2低氧2 h/复氧2 h+OGD 3 h/R 2 h为体外HPC+OGD/R模型。见图2。

注：与OGD3 h/R 2 h组比较，*P<0.05；A+OGD 3 h/R 2 h与B+OGD 3 h/R 2 h比较，#P<0.05；B+OGD 3 h/R 2 h与C+OGD 3 h/R 2 h比较，$P<0.05。A:1%O2低氧30 min/复氧30 min×4次；B:1%O2低氧2 h/复氧2 h；C:1%O2低氧30 min/复氧30 min×2次； D:1%O2低氧1 h/复氧1 h

2.3 不同处理组间NLRP3蛋白表达的变化 与常氧组比较，HPC组NLRP3表达有升高的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，HPC+OGD/R组和OGD/R组NLRP3均高于常氧组和HPC组(P<0.05)；但经低氧预适应处理后，HPC+OGD/R组的NLRP3表达明显低于单纯OGD/R组(P<0.05)，见图3。

注：OGD/R组与HPC+OGD/R组比较，*P<0.05；OGD/R组与N组比较，$$$P<0.001；HPC+OGD/R组与N组比较，##P<0.01；HPC+OGD/R组与HPC组比较，&P<0.05

3 讨论

低氧预适应是机体耐受低氧过程中产生的内源性保护机制，其具体机制到目前为止尚不十分明确。吕国蔚教授提出低氧耐受的组织和细胞机制可能是具有脑保护作用“好的基因”表达上调并使具有脑损伤作用“坏的基因”表达下调，例如，在已经报道的低氧预适应的分子机制中有血管内皮生长因子(VEGF)、红细胞生成素(EPO)和缺氧诱导因子(HIF)等这些神经保护介质上调[9，12]。本研究则通过体外OGD/R实验模拟了缺血性脑卒中后的缺血再灌注损伤，并观察到低氧预适应可以增加OGD/R后的细胞活力，而之前有体内实验研究表明，低氧预适应可以对缺血性脑卒中引起的神经损伤起保护作用，其机制可能与对抗缺血性脑卒中的神经元凋亡有关[10]，提示低氧预适应不仅可以对缺血性脑卒中而且对缺血性脑卒中后引起的缺血再灌注损伤起到保护作用。

炎症小体是近年来发现的，由模式识别受体参与组装的多蛋白质复合体结构[13]，NLRP3炎症小体是其中最受关注的炎症小体之一，也被认为是神经炎症发展的关键因素[7]。实验性缺血性脑卒中后发现NLRP3蛋白表达增加[14]，伴有IL-1b和IL-18水平升高以及广泛的神经元和胶质细胞死亡[15]，而干预NLRP3激活可减少脑卒中梗死体积并降低神经血管损伤水平。由此可见，在缺血性脑卒中缺血再灌注损伤过程中，NLRP3扮演了“坏的基因”， 其介导的神经炎症在缺血/再灌注损伤中也起到十分重要的作用。而在本实验中，通过对BV2细胞进行OGD/R处理模拟体内缺血性脑卒中后的缺血再灌注损伤，观察到NLRP3表达的升高，而经过低氧预适应处理后，可以降低NLRP3的表达，提示低氧预适应可以通过降低NLRP3这一“坏的基因”对缺血性脑卒中缺血再灌注损伤起到保护作用，但具体调控NLRP3表达的分子机制还需进一步的实验研究加以明确。