五味子乙素对慢性酒精中毒大鼠海马组织PSD-95蛋白表达的影响

(右江民族医学院，广西 百色 533000)

如今，随着经济社会的迅猛发展，人们生活水平在不断提高，生活方式慢慢改变，社交活动变得频繁，饮酒呈现一种社会趋势，尤其在一些民族地区更为突出。长期过量饮酒，酒精在体内大量堆积，可引起慢性酒精中毒。慢性酒精中毒起病隐匿，且病情表现多样，对脑损伤尤为严重，可导致记忆力减退、认知功能障碍等多种表现，因此，寻找有效解酒药物和改善慢性酒精中毒导致的学习记忆能力障碍的药物具有重要意义。五味子乙素(Schizandrin B，Sch B)是一类联苯环辛烯类木脂素，在中药北五味子中含量最高。目前，Sch B对大脑、神经元的保护作用及改善学习记忆方面的研究已取得了很大成就，但Sch B对慢性酒精中毒大鼠学习记忆能力障碍的影响作用方面的研究尚未见相关报道，本实验旨在探讨Sch B对慢性酒精中毒大鼠学习记忆能力障碍的影响作用及其相关机制，为开发改善学习记忆能力的辅助药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂 实验所用的动物均为清洁级健康成年雄性Wistar大鼠，体重180～200 g，由长沙天勤生物技术有限公司提供[许可证号：SCXK(湘)2014-0011]，采取分笼饲养，饲料供给充足，自由饮水。Sch B购于四川省维克奇生物科技有限公司，抗体突触后致密蛋白95(postsynaptic density protein-95，PSD-95)、GAPDH，辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗购于Proteintech公司，蛋白提取试剂盒购于索莱宝科技有限公司，BCA试剂盒、ECL显色液购于碧云天生物制品有限公司。

1.2 实验动物分组及方法 40只健康成年Wistar雄性大鼠随机分为5个组，每组8只大鼠，即为：正常组、模型组、Sch B 低剂量组、Sch B中剂量组和Sch B高剂量组。除正常组每天给予蒸馏水灌胃外，其余四组建立慢性酒精中毒动物组，以56°北京红星二锅头白酒灌胃：第一周以8 ml/(kg·d)剂量灌胃，从第二周起，每周增加1 ml，直至增加到10 ml/(kg·d)的剂量，1周后增至12 ml/(kg·d)的灌胃剂量，后按此剂量连续灌胃至第8周；动物模型建立成功后，Sch B低、中、高剂量组分别按10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg给予Sch B灌胃，1 d 1次，连续灌胃给药30 d后进行Morris水迷宫实验。

1.3 Morris水迷宫实验 动物模型建立完成后经过5 d的Morris水迷宫实验测试慢性酒精中毒大鼠学习记忆能力，Morris水迷宫实验包括两部分实验，定位航行实验和空间探索实验，定位航行实验检测空间记忆的获得和参照物记忆能力，过程为将动物先移入实验环境适应1周，实验第1 d将鼠放入水池中四个象限分别自由游泳60 s以适应环境，第2 d起将平台置于某一象限，进行获得性训练，每日训练4次即4个不同的象限各一次。实验时面向池壁将动物放入水中，每次实验间隔时间10 s，共训练4 d，动物找到平台后在平台上休息10 s，后继续进行下一个象限训练，若规定时间内未找到平台，则由操作者将其引导上平台，在平台上休息相同时间，再进行下一次实验。4 d的定位航行实验结束24 h后，撤除水下平台，选1个入水点将动物面向池壁放入水中，所有动物同一入水点，记录动物在60 s内第一次跨越平台时间即潜伏期、跨越平台次数等指标，电脑采集、描绘轨迹。

1.4 Western Blot免疫印迹 Morris水迷宫实验结束后，冰面上断头取出大鼠脑组织，迅速分离海马组织，取100 mg海马组织加入1 ml预冷裂解液，冰上匀浆，后置于冰盒中裂解30 min，将裂解完全后的样品于冷冻离心机上10 000～14 000 g离心3～5 min，取上清液，采用BCA法进行蛋白定量检测，配置上样体系并煮沸使蛋白变性，电泳，转膜，封闭，一抗4℃孵育过夜，洗膜，二抗室温振荡孵育1 h，显影定影，凝胶成像系统扫描灰度值，进行蛋白半定量分析。

2 结果

2.1 Sch B对慢性酒精中毒大鼠学习记忆能力的影响 Morris水迷宫实验结果显示，从定位航行实验轨迹采集图像看出，与正常组相比，模型组大鼠运动轨迹趋向性较差，多呈边缘化运动，偏离平台，且在目标象限运动轨迹明显减少，说明慢性酒精中毒导致学习记忆能力障碍，与模型组比较，各Sch B实验组运动轨迹较少趋向边缘化，运动轨迹更多趋向于目标平台(见图1)。定位航行实验结束24 h后，进行空间探索实验，结果显示，与正常组比，模型组潜伏期明显变长，而平台穿越次数变少(P<0.05)；与模型组比，Sch B低、中剂量组潜伏期逐渐缩短，而平台穿越次数逐渐增多，高剂量组潜伏期明显缩短(P<0.05)，且平台穿越次数明显增多(P<0.05)；并且可从运动轨迹图看出正常组、Sch B低剂量组、Sch B中剂量组、Sch B高剂量组游泳轨迹探索目标方向明确，在目标象限探索时间及路程都较模型组明显(见表1、图2)，说明Sch B能明显增强慢性酒精中毒大鼠寻找目标平台的记忆保持能力。

注：A:正常组；B:模型组；C:Sch B低剂量组；D:Sch B中剂量组；E:Sch B高剂量组

表1 Morris水迷宫空间探索实验潜伏期和平台穿越次数实验结果

注：A:正常组；B:模型组；C:低剂量组；D:中剂量组；E:高剂量组

2.2 Sch B对慢性酒精中毒大鼠海马组织PSD-95蛋白表达的影响 Western Blot免疫印迹实验结果显示，与正常组比较，模型组大鼠海马组织中的PSD-95蛋白表达减少(P<0.05)；给予Sch B药物治疗后，与模型组相比，Sch B低剂量组、Sch B中剂量组、Sch B高剂量组海马组织中的PSD-95蛋白表达逐渐增高，中、高剂量组PSD-95蛋白表达水平增高明显，且差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

A

B

图3 Western Blot法检测各组海马组织中PSD-95蛋白表达水平

注： A：Western blot电泳图；B：PSD-95蛋白相对表达量。与正常组比较，*：P<0.05；与模型组比较，#：P<0.05

3 讨论

随着社会进步迅速发展，人们生活水平越来越好，同时社会的进步带来了很多挑战，使得人们压力越来越大，应酬成为一种常态，酒精的非正常消耗问题日益凸显，且慢性酒精中毒治疗者复饮率也在不断提高，造成一系列严重的社会问题，近年来，滥用酒精问题更加严峻[1-3]。酒精具有很好的水溶性，饮酒后会迅速被人体胃肠黏膜吸收，随血液循环到达人体的各组织、器官贮存，因此长期过量饮酒，酒精在体内大量堆积，可引起慢性酒精中毒。同时酒精具备亲脂性小分子特性，其特征驱使酒精能快速通过血脑屏障抵达大脑，作用于脑组织，与神经细胞膜有较高的亲和力，并通过作用于膜上的某些酶类和受体而影响细胞的功能，进而引起学习、记忆、认知、判断等一系列神经行为功能的改变[4-5]。本研究中，行为学实验结果显示，慢性酒精中毒模型组大鼠运动轨迹趋向性较差，多呈边缘化运动，偏离平台方向，且在平台所在目标象限运动轨迹明显减少，寻找平台潜伏期延长，跨越平台次数也明显减少，说明长期过量饮酒引起慢性酒精中毒将导致学习记忆能力障碍发生，与文献[6]报道一致，但酒精中毒引起学习记忆障碍具体发生机制还没有明确。

Sch B是一类联苯环辛烯类木脂素，在中药北五味子中含量最高，且为木脂素中的单体化合物成分，Sch B具有改善认知功能的作用，主要包括兴奋中枢、改善学习和记忆功能[7]，有研究表明，Sch B能有效地抑制体外培养的神经元网络自发突触活动，进而调控神经元网络的兴奋性和网络神经元的同步性活动，抑制胞内同步钙振荡。且其能通过调控蛋白的表达而抑制阿尔茨海默症小鼠神经元线粒体凋亡，保护受损神经元，改善其学习记忆能力[8-9]。实验中，给予每天灌胃Sch B治疗后，大鼠运动轨迹较少趋向边缘化，运动轨迹更多趋向于目标平台，潜伏期缩短，跨平台次数增多，说明Sch B对慢性酒精中毒导致的学习记忆障碍有改善作用，但其改善作用尚机制未清楚。

海马区的主要功能是参与学习记忆，海马区神经元的损伤能引起学习记忆和认知判断障碍发生。神经系统可塑性改变最敏感的部位在于突触，其作用为在神经元之间传递信息和加工信息，人类行为表现记忆过程和记忆维持都与突触密切相关，记忆得以保持的根本取决于突触数量的稳定，但突触又不是恒定不变，其数量及结构可随体内外各种环境的改变而发生变化，突触可塑性影响着学习和记忆能力，突触丧失的结果可引起神经网络功能异常，从而导致信息传递障碍[10-11]。PSD-95是突触后致密物质中兴奋突触后致密物质主要的蛋白质成分，PSD-95通过其特有不同结构性质域与其它蛋白相互作用，在信号转导中起关键作用，是神经信息传递的重要基础，PSD-95 蛋白的组织性质和它动态重组的能力是酒精诱导突触效能改变的主要特征[12-13]。PSD-95是与突触传递紧密相关的主要蛋白之一，PSD-95表达水平与突触可塑性及其生物学功能密切相关，其表达下降说明突触可塑性降低[14]。本研究发现，酒精中毒模型组大鼠出现学习记忆功能障碍，且其海马组织中PSD-95 蛋白呈现低表达，说明PSD-95 蛋白表达水平降低与慢性酒精中毒导致海马突触可塑性及学习记忆能力的损伤相关，与文献[15]报道一致。Sch B低剂量组、中剂量组、高剂量组中，慢性酒精中毒大鼠学习记忆能力障碍得到改善，大鼠海马组织中的PSD-95 蛋白表达水平逐渐升高，说明Sch B可能通过调控海马区PSD-95 蛋白表达水平改善慢性酒精中毒大鼠学习记忆能力障碍。

综上所述，PSD-95是神经信息传递的重要基础，其表达下降说明突触可塑性降低，引起慢性酒精中毒大鼠学习记忆能力障碍，Sch B可能通过调控海马区PSD-95 蛋白表达水平改善慢性酒精中毒大鼠学习记忆能力，这可能是Sch B改善慢性酒精中毒大鼠认知能力障碍的机制之一，但其具体机制还需进一步研究和探讨。