大孔树脂分离纯化迷迭香中齐墩果酸的研究

赵军

【摘 要】目的：通过研究4种树脂对齐墩果酸的吸附性能和纯化效果，得到分离纯化齐墩果酸的最佳工艺。方法：通过4种大孔树脂的动态吸附，以齐墩果酸的吸附量、解吸率、齐墩果酸含量为指标，从中筛选出最佳的分离树脂为LX-200，再对其纯化参数进行优化对比。结果：LX-200大孔树脂分离纯化的最佳参数是上柱浓度为732 mg/L，上柱速度为2.0 BV/h，乙醇洗脱量为2.5 BV。结论：LX-200大孔树脂可以从迷迭香中很好地分离纯化齐墩果酸，所得到干粉的齐墩果酸最高含量为19.98%，为制备工业大生产提供参考。

【关键词】齐墩果酸;大孔吸附树脂;迷迭香;分离纯化

0 前言

齐墩果酸（Oleanolic Acid，OA）分子式为C30H48O3，是一种无色、无味、无臭的白色簇状针晶。分子式如图1所示。迷迭香具有强化肝脏功能的疗效。其中的齐墩果酸可作为广谱抗菌药，临床上用于护肝降酶，治疗支气管炎、肺炎、急性扁桃体炎、牙周炎、菌痢、急性肠胃炎、泌尿系统感染。此外，临床上还用于治疗急性肝炎。

近年来，齐墩果酸主要是提取来自女贞子，很少有从迷迭香中提取纯化报道，在迷迭香中的含量为0.8～2%。大孔树脂在植物提取中有着优良的使用，目前树脂分离已经是主要的纯化方式，具有可重复使用、无污染等显著效果。本文采用大孔吸附树脂法，对迷迭香中的齐墩果酸分离纯化工艺进行研究。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪购自安捷伦科技有限公司;FA2204N电子天平购自渡扬精密仪器（上海）有限公司自;JA5000C电子天平购自渡扬精密仪器（上海）有限公司;R-201D旋转蒸发仪购自上海耀特仪器设备有限公司。

1.2 试剂

大孔树脂T28购自西安蓝晓公司;大孔树脂LX-200购自西安蓝晓公司;AB-8购自江苏蘇青生物技术有限公司;XAd-8购自杭州争光树脂有限公司;齐墩果标准品99%购自中国药品生物品检定研究院;甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯，购自广州西陇化工产品。

1.3 实验原料

迷迭香原料：毕生药业公司提供。

2 高效液相色谱检测分析方法

2.1 色谱条件

色谱柱碳十八柱（ODS/C18）（250 mm×4.6 mm），检测波长为210 nm，，流动相为水（含0.1%H3PO4）：甲醇=（12：88 V/V），流速为0.8 mL/min，柱温为 28 ℃。

2.2 高效液相HPLC检测法

取齐墩果标准品99% 12.5mg，用无水乙醇25 mL定溶，溶解完全。采用逐级稀释法，取定溶的溶液 5 mL加无水乙醇到10 mL，依次取前次10 mL中5 mL加无水乙醇到10 mL，再取此次的2 mL加无水乙醇到10 mL，续取前次2 mL加无水乙醇到10 mL，混合均匀后，用高效液相检测。以峰面积与标准溶液的质量百分比浓度，就回归方程：Y=6.330 7X-31.509 R2=0.999 7，表明齐墩果酸浓度在5～100 mg/L范围内有良好的线性关系。

2.3 样品检测

取样品溶液，稀释到一定体积后，用高效液相色谱测定，通过回归方程计算齐墩果酸浓度。

3 实验方法

3.1 上样吸附液制备

取迷迭香原料10 kg，煮沸回流提取2次，每次加入7 L，70%乙醇，2 h提取1次，提取液过滤布200目，合并提取液，减压浓缩，离心，沉淀干燥，混匀，得提取物干粉1.5 kg。经测定，齐墩果酸为10%。实验前，取上述迷迭香提取物干粉，加70%乙醇，根据需要含量制成固体含量为5%～10%（质量体积百分数）的醇溶液，作为上样吸附液。

3.2 大孔树脂的活化预处理

树脂先用95%乙醇浸泡溶胀24 h，湿法装柱，用1 BV的树脂柱的95%乙醇洗脱树脂，接着用6倍量树脂的纯水加洗至流出液不变白色浑浊为止。然后依次用4%的氢氧化钠浸泡，纯水洗到pH中性，3倍量树脂体积的5%盐酸，冲洗树脂，最后用大量的纯水洗至流出的水中性，备用。

3.3 动态吸附树脂的筛选

準确移取4份为2 000 mL 8%吸附原液作为上样液，分别通过T28、LX-200、AB-8、XDA-8大孔树脂柱，（量取预处理的4种树脂各300 mL，分别装入直径为45 mm的玻璃柱，先用50%乙醇500 mL洗脱树脂）进行动态吸附，速度为6.0～6.5 mL/min，用500 mL 50%乙醇和用90%乙醇800 mL相同的速度洗脱，分别收集50%乙醇洗脱流出液（包含上样流出液）和90%乙醇洗脱液，浓缩，干燥。测定各干粉的齐墩果酸含量，计算其吸附量、解析率。筛选最好的树脂。结果 T28、LX-200、AB-8、XDA-8的吸附率分别为95.44、97.52、95.22、94.32，解析率分别为97.40、99.50、98.35、98.42，经比较选用LX-200树脂作为对齐墩果的分离纯化工艺进行研究（见表1）。

3.4 树脂对齐墩果的分离效果——吸附

3.4.1 上样液浓度对吸附效果的影响

准确称取齐墩果酸干粉，用70%乙醇稀释到浓度分别为366 mg/L、732 mg/L、1464 mg/L，每柱进样1.8 L溶液，过滤后按1.0 BV/h上柱吸附，用2.5 BV 90%乙醇洗脱，收集洗脱液，测定齐墩果酸的含量。结果显示：洗脱液含量最高为19.98%，树脂的回收率随着上样的浓度的增加而减少。说明树脂已经过饱和状态，综合这两者的优势考虑，确定上样量732 mg/L为最好的浓度（见表2）。

3.4.2 上样液流速对树脂吸附分离的影响

准确称取齐墩果酸干粉，用70%乙醇稀释到齐墩果浓度分别为732 mg/L，过滤后分别按1.0 BV/h、2.0 V/h、3.0 V/h、4.0 V/h的速度上LX-200树脂柱吸附，进完柱后，关闭流出阀，待吸附完全后，再用2.5BV 90%乙醇洗脱，收集洗脱液，测定齐墩果酸的含量和计算回收率。4种流速的含量和回收率分别为19.20%、19.98%、18.35%、16.25%和95.21%、95.66%、96.46%、97.05%。结果显示，随着流速的增加，洗脱液的含量逐渐降低，回收率是逐渐增加。综合干粉的含量和回收率的考察，选择2.0 BV/h为最佳流速（见表3）。

3.4.3 洗脱量对树脂吸附效果的影响

以优选的LX-200大孔树脂柱为载体柱，准确称取齐墩果酸干粉，用70%乙醇稀释到齐墩果酸浓度分别为732 mg/L，过滤后按2.0 V/h的速度上柱吸附，分别用1.5 BV、2.5 BV、3.5 BV、4.5 BV 90%乙醇洗脱，分别收集洗脱液，测定齐墩果酸的含量和计算回收率。不同的洗脱量的含量和回收率分别是18.55%、19.85%、19.53%、19.65%和89.02%、96.35%、93.54%、94.25%。結果显示，齐墩果酸的含量随着洗脱量的增加而增加，当达到2.5 BV后，稳定，没有很明显的增加，从工艺简化、成本生产可以确认最佳的洗脱量为2.5 BV洗脱（见表4）。

4 结论

齐墩果的生物活性功能受到越来越多的关注，作为肝病药物有效成分的最主要单体、功能性的成分，它具有潜在的价值和很大的应用前景。

本研究首先通过考察4种大孔树脂T28、LX-200，AB-8、XDA-8进行动态吸附，对比其树脂对有效成分的吸附率和解析性能，确定LX-200大孔树脂作为迷迭香中齐墩果分离纯化的载体。通过对LX-200大孔树脂的上样量、上样流速、洗脱量等因素对齐墩果酸纯化效果考察，得到LX-200大孔树脂分离纯化的最佳条件：上柱浓度为732 mg/L，上柱速度为2.0 BV/h，90%乙醇洗脱量为2.5 BV可以得到最佳的纯化效果。

结果表明，LX-200大孔树脂作为填料，可以很好地分离出迷迭香中的齐墩果酸，工艺简单，容易操作，全程没有用到有毒试剂，污染小，为工业大规模生产提供很好的工艺参考。纯化后，对环境产品采用HPLC检查，其含量达到19.98%，产品淡黄色，可满足市场对齐墩果的含量要求。

参 考 文 献

[1]中国药典委员会.中华人民共和国药典·第一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：61.

[2]冷桂华.RP-HPLC-PAD法测定迷迭香中乌索酸和齐墩果酸的含量[J].食品科学，2011（12）：243-245.

[3]黄新苹，王玲，王武朝.大孔树脂纯化对女贞子中齐墩果酸的提取工艺优化[J].国际药学研究杂志，2016（6）：1117-1122.

[4]金文芳，李波，吕绒昌，等.大孔树脂纯化马兰总三萜工艺研究[J].安徽中医学院学报，2017（5），92-94.

[5]张蜀艳，李政.齐墩果酸研究进展[J].食品与发酵科技，2010，46（4）：20-24.