天然活性多糖提取及分离纯化技术研究进展

杨丽华，林楚慧，黄佳銮，姚松君，高新开，李丹，胡烨敏，孟平，焦红，陈骁熠

摘要：天然活性多糖是自然界重要的生物大分子之一，因其具有广泛的生物活性而备受关注。由于多糖的生物活性与其纯度及化学结构有着重要的关系，因此多糖的提取和分离纯化是多糖研究的基础。就近年来天然活性多糖的提取方法、分离纯化技术的最新研究进展进行了综述，并比较了各种方法的优缺点，旨在为天然活性多糖的开发应用提供参考。

关键词：天然活性多糖;提取;分离纯化;开发应用

中图分类号：Q946.3;R284.2        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）23-5624-04

天然活性多糖是广泛存在于植物、动物及微生物中由10个以上的单糖以α-或β-糖苷键构成的天然大分子[1]，因其具有多种生物活性和无毒副作用，在保健食品及医疗行业中被广泛利用。目前国内外关于天然活性多糖的研究报道主要集中在药理、临床应用等方面[2-4]，有关提取和分离纯化的报道相对较少。然而，多糖的生物活性与其化学结构及纯度有着重要的关系[5]，因此多糖的提取、纯化是多糖研究的基础。本文就近年来天然活性多糖的提取方法、分离纯化技术的研究进展进行了综述，并比较了各种方法的优缺点，旨在为天然活性多糖的开发应用提供参考。

1  多糖的提取

多糖的提取是指利用一定的原理和方法将天然产物中的活性多糖溶出或释放至细胞外。目前，国内外提取多糖的方法主要有溶剂提取法、酸、碱提取法、酶解法、超声波提取法、微波提取法和超临界流体萃取法。

1.1  溶剂提取法

溶剂提取法主要是利用提取溶剂的扩散和渗透作用，将天然产物中活性成分溶出。一般来说，溶剂极性越大，对组织细胞的穿透力越强，提取效果就越理想。Chen等[6]用水提法提取大漏斗菇中的多糖，提取率达5.86%。曾红亮等[7]以乙醇体积分数、液料比、提取温度、提取时间和提取次数为考察因素，利用响应曲面法研究了金柑多糖的最佳工艺，以70%乙醇为提取溶剂，液料比为38 mL/g，在88 ℃下提取3次，每次2.5 h，得到的多糖提取率为1.80%，与理论预测值相当。

该法无需复杂的仪器设备，工艺成本相对较低，应用广泛，但需要多次提取以保证提取率，耗时较多。此外，若使用水为提取溶剂，由于水的溶解范围广，在提取活性多糖的同时也浸提出大量的非多糖组分，这也增加了去除多糖中杂质的难度。

1.2  酸、碱提取法

碱液提取法是利用植物细胞在碱液中会吸水溶胀以致破裂，使细胞中的活性物质释放出来的原理提高提取率。常用的碱液有NaOH、KOH、Na2CO3。但对于在碱性较强时会水解多糖，在实际操作中需要加入硼氢化钠或硼氢化钾来防止其降解。马洪波等[8]使用氢氧化钠溶液提取桑叶多糖，正交试验结果显示，1.5 mol/L碱液浓度，固液比为1∶50，在80 ℃提取4 h，多糖提取率可达2.55%，略高于水提取法。赵晨溟等[9]用几种不同的方法提取龙眼中的多糖，结果表明，对于含半乳糖较多的多糖，碱提取法提取率较高。

碱提取法适合于提取酸性多糖或分子量较大的多糖，比溶剂提取法相对省时。但使用碱液提取法时，碱液的浓度必须要控制在适当范围内，如果浓度过高，会使糖苷键断裂且多余的碱液与还原糖发生反应，将还原糖分解，使溶液颜色加深，加大后续的脱色工作量。

酸液提取法的原理与碱提取法基本相同，该法适用于半乳糖醛酸含量丰富的多糖的提取。使用酸提取法时同样要严格控制其溶液酸度，否则会破坏多糖的结构。

1.3  酶解法

酶解法是根据细胞壁的构成，利用酶反应所具有的高度专一性等特点，选择相应的酶将细胞壁的组成成分水解或降解，破坏细胞壁结构，将细胞内有效成分提取出来的方法[10]。常用酶包括纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等。酶解法关键在于使酶活性达到并保持最佳状态，这就需要考察酶用量、底物浓度、pH、温度及作用时间等因素的影响。You等[10]使用2.15%复合酶，在pH 4.2，55 ℃温度下提取97 min，山茱萸多糖提取率高达9.29%。

酶解法反应条件温和，提取速度快，提取率高，可重复性好[11]，操作简便。不足的是，酶解法存在酶残留及酶降解产物的去除问题。

1.4  超声波提取法

超声波提取法是利用超声波高频振荡的空化作用、机械作用和热力学作用等破坏提取物的细胞结构，使提取液渗入细胞内部，加速多糖溶解，从而提高多糖提取率[12]。Qu等[13]采用超声波提取红枣多糖，利用响应面法考察各因素对多糖提取率的影响，结果表明，在功率120 W，温度 55 ℃下超声提取15 min，红枣多糖提取率可达4.47%，与理论预测值相符。Chen等[14]用超声波提取万年青多糖，在最佳提取工艺下得到的多糖含量高达（36.77±1.76）%。

超声波的处理温度低，与传统的水提法比较，提取时间短且提取率较高，然而，在使用超声波提取法时应注意控制时间[15]，超时间的振荡可能会导致大分子多糖断裂而影响其生物活性。

1.5  微波提取法

微波是频率介于300 MHz～300 GHz的电磁波，其强大的穿透力可透过细胞壁到达细胞内部，使细胞内部产生高温高压[16]，当压力超过细胞的承受压力时，细胞膜和细胞壁就会被破坏而产生微孔或裂纹，细胞内的有效成分随之进入周围的溶剂中。刘小丽等[17]用微波法提取香菇中多糖，最佳提取时间仅需5 min，其多糖提取率可达9.46%。Zhang等[18]研究不同提取方法对金针菇多糖提取率的影响，发现微波提取法得到的多糖提取率最高且耗时最少，提取率约比热水提取法高3%。

微波提取法具有加热均匀、提取快速等优点[19]，可大大缩短提取时间，提取效率高，但该法不适用于热不稳定化合物。

1.6  超临界萃取法

超临界萃取是以超临界流体为溶剂，从提取物中萃取有效成分的技术。超临界流体既有液体的高溶解性，又有气体的高扩散性，容易穿进提取物基质中[20]，由于CO2的超临界条件（温度304.6 ℃，压力7.38 MPa）容易达到，常被作为超临界萃取的溶剂。陈明等[21]利用CO2超临界萃取法提取绿茶多糖，在绿茶粉颗粒度为40目，萃取压力35 MPa，45 ℃下萃取2 h，绿茶多糖提取率达到了92.50%。

CO2超临界流体法溶解性好，分析效率高，提取结束后CO2可减压回收，不存在残留问题，该法在天然多糖的提取应用中前景较大。缺点是设备复杂，运行成本高，提取范围有限。

比较以上几种方法可知，多糖的提取方法中，溶剂提取法应用最广泛（尤其是水提法）;最节省时间且提取效率高的是微波提取法;对于分子量较大的多糖，用碱提取法较好;而对于半乳糖醛酸含量丰富的多糖，用酸提取法较好;酶解法可以制备相对较纯的多糖，但需要解决酶残留和酶降解物的去除问题;超临界萃取法保持多糖的生物活性效果最优，但该方法运行成本相对较高。

2  多糖的分离纯化

天然多糖提取之后，常会混合蛋白质、小分子物质及色素等杂质。要得到单一组分，一般要先去除非多糖组分，再进一步对多糖组分进行分离纯化[22]。

2.1  非多糖组分的去除

由于多糖难溶于有机溶剂，因此，常用乙醇或丙酮进行反复沉淀洗涤，除去一部分醇溶性杂质，然后用Sevag法/三氟三氯乙烷法/三氯醋酸法去除游离蛋白质，其中Sevag法最为常用。Sevag试剂不影响多糖的结构，可避免多糖的降解，该法温和，缺点是需要多次反复才能把蛋白质除尽。小分子杂质的去除可以用透析法，该法操作简单，技术成熟，但是周期较长，常温下操作有可能导致多糖霉变[23]。色素的去除则根据其不同性质采取不同的除色素方法，常见的有离子交换法、氧化法、金属络合物法、吸附法（纤维素、藻土、高岭土、活性炭）等。

2.2  分离纯化

杂质去除后还需要进一步分离纯化，从粗多糖中得到均一的高纯度活性多糖组分。分离纯化多糖的方法很多，主要有沉淀法、金属络合物法、高效液相色谱法、柱层析法、超滤法和电泳法等。其中比较常用的是柱层析法和高效液相色谱法，本文着重对多糖的柱层析纯化法进行综述。

柱层析法是以固体吸附剂为固定相，以溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。其原理是利用吸附剂对混合样品中各组分的吸附力不同而使各组分分离[24]，当采用溶剂洗脱时，发生一系列吸附→解吸→再吸附→再解吸的过程，吸附力较强的组分后出柱，吸附力较弱的组分先出柱，根据出柱顺序的不同而达到分离。常用的多糖柱层析纯化法有凝胶柱层析法和纤维素阴离子交换柱层析法。

2.2.1  凝胶柱层析法  凝胶柱层析又称分子筛过滤或排阻层析，利用凝胶的分子筛作用，根据多糖分子大小的不同进行分离[25]，常用葡聚糖凝胶（Sephadex）、聚丙烯酰胺凝胶（Sephacryl）、琼脂糖凝胶（Sepharose）为固定相，去离子水或稀盐溶液为洗脱液。不同的凝胶都有其相对应的相对分子质量范围，试验前应根据目标多糖的相对分子质量大小选择合适的凝胶。一般情况下，大分子的先出柱，小分子的后出柱。值得注意的是，凝胶柱层析法不适合于黏多糖的分离。侯庆爱等[26]以海带为原料，研究了岩藻多糖的提取工艺，其最佳条件为料液比1∶20，温度80 ℃，提取3次，每次10 h，岩藻多糖得率为25%，经葡聚糖凝胶柱层析纯化，纯度可达93%。

2.2.2  纤维素柱层析法  纤维素柱层析法一般用DEAE树脂作交换剂，适合分离各种酸性多糖、中性多糖和黏多糖，其吸附力随着活性多糖分子中酸性基团的增加而增加[27]。洗脱剂为不同浓度的碱液、盐溶液或硼砂等。Popov等[28]以新鲜李子为原料，采用DEAE-纤维素分离纯化粗多糖，用NaCl溶液进行等度洗脱，得到2种结构不同的多糖组分。Xu等[29]利用DEAE-52纤维素离子交换层析，从茶花粗多糖中得到鼠李糖、阿拉伯糖和甘露糖等8种单糖。

在实际纯化多糖工作中，往往需要综合应用不同方法才能达到分离纯化的效果。Zhang等[30]采用热水-超声辅助提取和乙醇沉淀获得砂仁粗多糖，脱蛋白后经DEAE-52纤维素离子交换柱层析分离纯化得到ASP（砂仁多糖），ASP再经Sephadex G-100分离纯化得到ASP-1、ASP-2和ASP-3三个组分，经气相色谱法、液相色谱法和红外光谱鉴定表明其单糖成分为葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖等。Wang等[31]分别用琼脂凝胶Q Sepharose柱层析对土曲霉水溶性粗多糖的截留液进行初步分离，得到的组分再用丙烯葡聚糖凝胶SephacrylS-100柱层析系统进行进一步分离和纯化，得到平均相对分子质量为18.6 kDa的纯化物。

3  展望

天然多糖因其丰富的生物活性日益受到重视，在医药、农业、食品等方面有着较大的应用价值。中国丰富的天然资源为活性多糖的开发利用提供了得天独厚的条件，然而由于多糖种类繁多、结构相对复杂、分离纯化难度较大等诸多因素，给天然活性多糖的研究和应用带来了不少的挑战。运用不同提取方法、分离纯化技术对各种活性多糖进行开发和比较，仍然是天然活性多糖研究工作的重点。

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