高通量测序法分析感杨树灰斑病前后叶围微生物多样性1)

邓世林 申东晨 潘理 刘思远 郑浩楠 沈嘉乙 董爱荣

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

杨树(Populusspp.)在我国主要用于防护林、用材林、水土保持林、农田防护林和四旁绿化。杨树灰斑病(CoryneumpopulinumBres.)是发生在杨树(小苗到大树)上的一种主要叶部病害。该病能使叶片提早脱落，嫩梢枯死或造成多顶苗[1]。目前,对杨树灰斑病的防治主要以化学药剂防治为主[2-3]，但化学杀菌剂常常带来许多负面影响，如对环境的污染，对人畜的毒副作用等，因此必须寻找新的防治途径克服农药残留和病菌抗药性的问题。近年来，运用生物防治措施控制病害已成为病害防治的必然趋势，这也是国际上目前在病害防治方面的重点研究领域，运用拮抗微生物来防治灰斑病无疑是一种行之有效的方法[4-5]。获得拮抗微生物的传统方法是人工富集培养，然而，有研究表明自然界中存活的微生物只有0.1%～10.0%可以通过人工方法获得纯培养[6]，大量的微生物因无法获得纯培养而对其性质及其在自然界中的生态功能知之极少。相比较而言，高通量测序法更为准确快捷[7]，同时有利于探究在实验室培养条件下会忽略的低丰度菌群种类[8]。本研究基于高通量测序法分析杨树感灰斑病前后叶围微生物多样性和群落结构的变化,探知优势微生物的分布，从而指导筛选杨树叶围优势的灰斑病拮抗菌。

1 材料与方法

1.1 试验材料

健康小黑杨(Populussimonii×P.nigra)、发病小黑杨叶片均采自黑龙江省肇东市五站林木种子园。2019年7月24日，采用“S”形十点采样法，分别剪取10棵2年根3年干健康及感灰斑病杨树枝叶。健康样品用A1表示，感病样品用A2表示。

1.2 小黑杨叶围微生物基因组DNA提取

称取10.0 g来自于不同枝条上的小黑杨叶片，用无菌的剪刀剪碎后，放入10 mL离心管中，加入适量钢珠和裂解液，在破碎仪上进行破碎，参照OMEGA试剂盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit的使用说明书，提取样品DNA。利用Tris盐酸缓冲液(pH=8.0)洗脱DNA并置于-20 ℃条件下冻存，送至生工生物工程(上海)股份有限公司完成扩增子测序。

1.3 数据分析

细菌16S rRNA选择341F和805R作为引物，引物序列分别为5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′和5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′；真菌ITS选择ITS4F和ITS3R作为引物，分别为5′-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTN-3′和5′-GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′，利用Illumina Mi Seq平台进行测序和分析。下机数据经过QIIME(v1.8.0)软件过滤、拼接、去除嵌合体，去除各样本中reads尾部质量值在20以下的碱基、切除reads中含N部分序列，并去除数据中的短序列(长度阈值200 bp)，随后再对低复杂度的序列进行过滤。

采用Usearch(v7.1)软件进行数据处理，物种比对注释使用RDP classifier软件，保留置信区间大于0.8的注释结果。利用Mothur软件进行Chao1指数、香农指数(Shannon)计算分析，并在各分类水平上进行群落结构的统计分析，得到微生物群落结构组成。

2 结果与分析

2.1 感病前后样品的细菌和真菌多样性

由表1可知，感病前后分别检测到395、97个细菌OTU，2 144、954个真菌OTU，感病后样品A2的OTU数、Shannon指数和Chao1指数明显下降，说明感病后，病原菌占绝对优势，且对其他微生物产生一定的抑制作用，细菌、真菌多样性及物种总数显著下降。

表1 感病前后小黑杨样品的细菌和真菌多样性指数

由图1可知，感病前后样品共含有492个细菌OTU，2组样品共有的细菌种类仅有27个，占细菌总数的5.49%，说明杨树感染灰斑病菌前后，叶围细菌发生了较大改变。感病前后样品共含有3 098个真菌OTU，2组样品共有的真菌种类仅有22个，占真菌总数的0.71%，说明杨树感染灰斑病菌前后，叶围真菌发生了巨大的变化。这与表1的结果基本吻合。

2.2 感病前后样品的细菌群落结构差异性

由表2可知，从细菌分类门的水平看，2个样品主要含有5个门的细菌，包括：变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、广古菌门(Euryarchaeota)和拟杆菌门(Bacteroidetes)。

在门水平下，感病前后样品中的细菌群落结构组成不尽相同，A1样品主要含有变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)3个门，丰度分别为89.05%、7.13%和3.25%，三者合计高达99.43%，其他门以及未鉴定的细菌丰度均在0.27%以下。A2样品主要含有变形菌门、厚壁菌门、广古菌门、放线菌门和拟杆菌门5个门，丰度分别为82.48%、5.84%、5.11%、2.19%和1.09%，其他门以及未鉴定的细菌丰度均在0.73%以下。结果表明：杨树感染灰斑病菌后，细菌群落结构组成发生了较大的变化，变形菌门、放线菌门和拟杆菌门丰度均不同程度下降，而其他细菌门丰度均呈不同程度上升。

根据物种分类结果，由于样品中所检测出的细菌种类繁多，许多物种含量十分少，因此筛选出优势物种，对细菌平均丰度前15的物种进行分类统计。从细菌分类属水平看，2个样品丰度前15个属的细菌，包括：鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、马赛菌属(Massilia)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、Frondihabitans、根瘤菌属(Rhizobium)、Methanoculleus、泛菌属(Pantoea)、Hymenobacter、Aureimonas、芽孢杆菌属(Bacillus)、氮单胞菌属(Azomonas)、贪噬菌属(Variovorax)和不动杆菌属(Acinetobacter)。

在属水平下，2组样品中的细菌群落结构组成也不尽相同，且差异较大的是相对丰度。A1中鞘氨醇单胞菌属、甲基杆菌属、马赛菌属、Frondihabitans、根瘤菌属、Hymenobacter和Aureimonas丰度高于A2组，其中，Hymenobacter、Aureimonas仅存在于A1组中；而A2中假单胞菌属、短波单胞菌属、Methanoculleus、泛菌属(Pantoea)、芽孢杆菌属、氮单胞菌属、不动杆菌属丰度高于A1组，其中，芽孢杆菌属仅存在于A2组中。

表2 感病前后小黑杨样品细菌群落结构分布

2.3 感病前后样品的真菌群落结构差异性

由表3可知，从真菌分类门水平看，2组样品主要含有3个门的细菌，即：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、接合菌门(Zygomycota)。

在门水平下，感病前后样品中的真菌群落结构组成基本相同，差异较大的是相对丰度。这说明2组样品中群落结构未发生根本改变。子囊菌门是样品中的优势真菌，其中，A1样品的丰度为56.81%，略大于A2样品的丰度(46.50%)。其次是担子菌门和接合菌门，其他和未鉴定的真菌平均丰度分别为40.60%和51.35%。

根据物种分类结果，由于样品中所检测出的真菌种类繁多，许多物种含量十分少，因此筛选出优势物种，只对真菌丰度前15的物种进行分类统计。从真菌分类属水平看，2组样品平均丰度前15个属的真菌包括：部分无法确定的子囊菌(unclassified_Ascomycota)、镰刀菌属(Fusarium)、枝孢属(Cladosporium)、棒盘孢属(Coryneum)、尖座壳属(Diaporthe)、炭疽菌属(Colletotrichum)、短梗霉属(Aureobasidium)、壳二孢属(Ascochyta)、尾孢属(Cercospora)、Plectosphaerella、青霉属(Penicillium)、黄曲霉属(Aspergillus)、Sydowia、短梗蠕孢属(Trichocladium)和链格孢属(Alternaria)。

表3 感病前后小黑杨样品真菌群落结构分布

在属水平下，2组样品中的真菌群落结构组成基本相同，差异较大的是相对丰度。A1中部分无法确定的子囊菌、枝孢属、短梗霉属、壳二孢属、青霉属、黄曲霉属、Sydowia、短梗蠕孢属、链格孢属丰度高于A2组，其中，短梗霉属和Sydowia仅存在于A1组中；而A2中镰刀菌属、棒盘孢属、尖座壳属、炭疽菌属、尾孢属、Plectosphaerella丰度相较于A1组高，其中，尖座壳属、炭疽菌属和尾孢属仅存在于A2组中。

3 结束语

本研究表明，小黑杨感灰斑病后，病叶上微生物物种数量较健康叶变化明显，但在门及属水平上差异不显著。在门水平下，变形菌门是2组样品中的优势细菌，子囊菌门是2组样品的优势真菌。在属水平下，鞘氨醇单胞菌属是健康叶中的优势细菌，假单胞菌属是病叶中的优势细菌；枝孢属是健康叶中的优势真菌，镰刀菌属是病叶中的优势真菌，其次是棒盘孢属。