双色茉莉叶片初代培养物的建立及愈伤组织诱导1)

马丽 郭学良 周胜楠 王颖 田维爽 闫世月

(商丘师范学院，商丘 , 476000)

双色茉莉(BrunfelsialatifoliaBenth.)，又名番茉莉、鸳鸯茉莉，是茄科鸳鸯茉莉属常绿矮灌木，株高30～100 cm。叶片呈长卵形，暗绿色，单叶互生。花单生或几多密生，聚伞花序，花被具五浅裂，好似五瓣梅花。双色茉莉花初开为淡紫色，后逐渐转变成白色，单花开放3～5 d，花期4—10月份。因花开有先后，同一株双色茉莉常能观赏到两种颜色的花朵，故名双色茉莉[1]。花开期间芳香扑鼻，为观赏者展示了一个更迭变换的空间，使观赏变得饶有趣味，深得人们的喜爱。

双色茉莉结实少或不结实，限制了双色茉莉有性繁殖的发展；而采用扦插、高空压条等无性繁殖的方法，成苗慢，生根较难，且植株生长不良，不利于工厂化生产[2]。植物组织培养技术为植物的大量快速繁殖提供了新的途径。植物组织培养研究至今已有100多年历史，已成为生物学科研究的重要技术手段[3]。目前，许多观赏植物、园艺作物、经济林木、无性繁殖作物等均已采用组织培养技术进行离体快速繁殖并获得了成功，试管苗生产在国内外市场上已经形成产业化[4]。近几年，随着经济水平的提高，观赏花卉需求量剧增，各类观赏花卉的离体快速繁殖体系的建立成为近年来研究的热点。目前，有关双色茉莉的组织培养也有报道，但多见于用茎段或茎尖为外植体进行腋芽或顶芽的诱导和增殖[5-6]。而对双色茉莉经过愈伤组织途径进行离体再生的研究鲜见报道。通过愈伤组织进行不定芽诱导，由于不定芽形成的数量与腋芽数目无关，其增殖率高，易形成芽丛且繁殖速度快[7]。20世纪80年代，付凯等[8]最早简述了利用双色茉莉嫩叶进行组织培养的方法，但没有经过愈伤组织途径，而是直接从叶枕处分化出不定芽，转接到生根培养基中，且生根率高达90%以上。袁媛等[9]以双色茉莉的花瓣、叶片、茎段为外植体进行了研究，指出嫩叶的污染率最低，且愈伤诱导率最高，平均出愈时间最短。

本研究以双色茉莉叶片为外植体，探讨取材时期、消毒时间、不同植物生长调节剂组合对愈伤组织诱导的影响，以期筛选适宜于双色茉莉愈伤组织诱导的培养基，为双色茉莉离体快繁提供理论依据，也为双色茉莉高效、优质生产奠定基础，以满足市场的需求。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为商丘市金世纪花卉市场购买的3年生双色茉莉，开花时颜色由深蓝色转为浅紫色，最后转变为白色，在温室养护1个月左右进行试验。

1.2 材料处理及培养条件

选择天气晴朗的下午，摘取双色茉莉幼嫩且完全展开的叶片(顶端第3～5片叶)。放入清洗干净的烧杯中，加入肥皂水漂洗5～10 min，洗净叶片上的灰尘以及其他附着物，再用纱布盖好烧杯口，在流动的自来水下冲洗30 min。接种之前，在超净工作台上，将叶片用75%酒精处理10 s，在无菌水中浸泡3～5 min，然后用0.1%氯化汞溶液浸泡6 min，最后用无菌水冲洗4～5次。在超净工作台上进行无菌操作，用解剖刀垂直叶脉划出伤口，将叶片切成约0.5 cm×0.5 cm大小，正面朝上接种在培养基上。

培养基在121 ℃条件下灭菌20 min，高温灭菌前pH值调至5.8左右；接种后在培养温度为25 ℃，光照时间为12 h·d-1，光照强度2 000 lx的无菌室中培养。

1.3 试验设计

取样时期试验：分别在4、5、6、10月份进行初代培养，每瓶接种3个外植体，每个时期接种20瓶，观察愈伤组织生长状况。

消毒时间试验：以MS+1.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1NAA为培养基，4月份取幼嫩叶片，升汞消毒时间分别设定为3、4、5、6、7、8 min，接种30 d后观察愈伤组织生长状况。

不同激素配比试验：在MS培养基中添加不同质量浓度的6-BA、NAA、KT，培养基中加入琼脂6 g·L-1、蔗糖30 g·L-1。4月份取幼嫩叶片接种，30 d后观察愈伤组织生长情况。不同激素配比组成见表1。

1.4 测定指标与方法

污染率=(污染数/接种数)×100%。

愈伤组织诱导率=(未污染外植体产生愈伤组织数/未污染外植体总数)×100%。

愈伤化程度的测定指标：“+”表示小于50%叶片划伤处；“++”表示大于50%叶片划伤处；“+++”表示大于50%叶片划伤处和主脉部位；“++++”表示大于50%叶片划伤处、主脉部位和叶片表面或背面被愈伤组织覆盖。

表1 不同激素配比组成

2 结果与分析

2.1 取材时间对愈伤组织诱导的影响

表2显示，4月份和10月份诱导愈伤组织生长状况最好，呈翠绿色颗粒状，且污染率较其他时期明显降低，仅分别为5.5%、6.7%，而5月份和6月份污染率分别为34.5%和48.7%。且4月份和10月份诱导率均达100%，而5月份和6月份愈伤组织诱导率仅为51.8%和42.8%。同时，4月份和10月份采集的叶片出愈时间较早，其愈伤组织形成高峰期比5月份和6月份的材料平均提前5 d，且4月份和10月份的愈伤化程度较高，有利于双色茉莉的离体快速繁殖。

表2 取材时间对愈伤组织诱导的影响

2.2 消毒时间对愈伤组织诱导的影响

由表3可以看出，增加升汞对外植体的浸泡时间可以有效降低污染率，但是过长的时间也会使叶片的生理功能受到不同程度的损伤。将叶片在升汞中浸泡7～8 min，叶片明显失去原有的绿色，且产生的愈伤组织呈现黄绿色；而浸泡时间为3～4 min时，叶片虽然保持了原有的生理活性，但是愈伤化程度较低，且诱导产生的愈伤组织生长状况不佳；浸泡5～6 min时，叶片的愈伤化程度最高，且愈伤组织生长状况最优。综上所述，以双色茉莉叶片为外植体，在0.1%氯化汞溶液中浸泡5～6 min最有利于双色茉莉叶片愈伤组织的诱导。

表3 消毒时间对愈伤组织诱导的影响

2.3 不同激素配比对愈伤组织诱导的影响

由表4和图1中M1～M8处理相比可以看出，细胞分裂素质量浓度/生长素质量浓度对诱导愈伤组织有一定影响，比值相同的愈伤化程度和愈伤组织生长状况基本一致，其中M4、M5、M6、M8处理细胞分裂素质量浓度/生长素质量浓度为1/4～1，诱导产生的愈伤组织生长状况较优，且愈伤化程度较高。由此可见，NAA有利于诱导双色茉莉叶片愈伤组织的诱导，而高质量浓度6-BA则相反，不利于愈伤组织的形成。有利于双色茉莉叶片愈伤组织诱导的培养基为MS+1.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1NAA、MS+1.0 mg·L-16-BA+2.0mg·L-1NAA、MS+1.0 mg·L-16-BA+4.0 mg·L-1NAA和MS+2.0 mg·L-16-BA+2.0 mg·L-1NAA。

与M4相比，M9～M11中加入了KT，由表4和图1可见，添加不同质量浓度的KT溶液对诱导愈伤组织没有产生正向作用，其愈伤化程度和愈伤组织生长状况均不及未添加KT的处理，且划伤处愈伤组织颜色明显变为墨绿色水浸褐化状。因此，KT不利于双色茉莉叶片诱导愈伤组织的诱导。

表4 不同激素配比对愈伤组织诱导的影响

3 结论与讨论

本研究表明，取材的时间和部位直接影响了双色茉莉叶片诱导愈伤组织的诱导，4月份和10月份为取材的最佳时期，诱导率最高，这与前人研究结果一致，王玲平等[10]在研究双色茉莉茎段离体培养时也指出，4月份和10月份取材最好，诱导率达84%～93%；袁媛等[9]也指出，3、4月份取材叶片效果较好。这可能是因为，3—4月份和10月份分别为双色茉莉春梢和秋稍生长期，生长代谢比较活跃，有利于愈伤组织的诱导，且新生嫩叶与外界接触时间较短，因此污染率较低。

升汞消毒时间为5～6 min时效果最佳，污染率低，且保持了叶片最佳的生理状态。升汞消毒时间短，不能有效杀死微生物，而消毒时间过长又会对材料造成伤害，而最佳消毒时间为5～6 min。而吕孟雨等[6]用0.2%升汞对茎尖消毒的最佳时间为5 min；本研究中选用的升汞质量分数为0.1%，外植体选择叶片，最佳消毒时间为5、6 min时，污染率控制在5%；而刘敏杰等[5]指出，茎段消毒的最佳时间为3 min，时间长容易发生褐化。这说明与茎段相比，叶片和茎尖更耐升汞消毒。

生长调节物质的质量浓度及配比影响产生愈伤组织的质量，6-BA质量浓度/NAA质量浓度分别为1/4、1/2、1的培养基诱导产生的愈伤组织生长状况较优，且愈伤化程度较高，6-BA质量浓度/NAA质量浓度过高则不利于叶片愈伤组织的诱导，因此，适宜于愈伤组织诱导的6-BA质量浓度/NAA质量浓度为4/1～1。本研究指出，KT的添加不利于双色茉莉叶片愈伤组织的诱导，KT在双色茉莉组织培养中的应用，前人也鲜有报道。前人通过对其他植物组织培养的研究指出，随着KT质量浓度的增加，愈伤组织诱导率呈下降趋势[11-12]，与本研究结果一致。关于双色茉莉叶片组织培养的报道较少，本研究探索出双色茉莉叶片愈伤组织诱导适宜的培养基为MS+1.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1NAA、MS+1.0 mg·L-16-BA+2.0 mg·L-1NAA、MS+1.0 mg·L-16-BA+4.0 mg·L-1NAA和MS+2.0 mg·L-16-BA+2.0 mg·L-1NAA，这为双色茉莉叶片进一步分化成完整植株奠定了基础。