均相酶法检测尿液雌三醇的方法学性能评估

裴蕴锋

（江苏省徐州市中心医院检验科，江苏 徐州 221009）

雌三醇（estriol, E3）是重要的内源性雌激素之一，为雌酮和雌二醇的代谢产物，主要由肝脏合成，男性和未孕妇女体内含量很低；孕妇体内E3的主要来源是婴儿和胎盘，且含量较高。经胎盘合成的E3可与葡萄糖醛酸等形成结合型E3，从尿液中排出。随着孕期增长，血液中E3浓度逐渐升高，尿中排出量也渐增加，至分娩后迅速下降[1]。妊娠期检查时，通过检测孕妇血清或尿液中E3含量，可指示胎盘功能、判断胎儿发育状况[2]。

常用的E3检测方法有：高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-质谱法（LC-MS）、免疫标记分析法（ELISA、RIA、TRFIA）和化学发光免疫分析法（CLIA）等，由于仪器购置、检测技术等存在局限性，上述这些方法在临床实验室难以推广应用[3]。

本文对苏州博源生产的E3均相酶法检测试剂进行评价，以验证其在正确度、精密度、线性试验、可报告范围及中晚孕期孕妇参考区间等的性能。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料 标本来源于本院产科孕检中心，共观察32～33 孕周、36～37 孕周及39～40 孕周的健康孕妇各20 例，采集24 h尿液标本，2 ℃～8 ℃冷藏保存待检。

1.2 仪器与试剂 仪器为Beckman DX 1800。试剂由苏州博源医疗科技有限公司提供，E3试剂、校准品、质控品批号分别为200630、200526、200526。

1.3 方法

1.3.1 仪器校准与质控：根据试剂使用说明书推荐的E3方法学参数进行校准；每日检测高、低两个不同浓度的质控品，确保在控后方可进行实验。性能验证过程中，如出现随批室内质控失控或其它操作问题，则整批数据弃去，须增加一批次测量。

1.3.2 正确度评价：以与E3项目定标所用校准品批号不同的校准品为已知参考物，重复检测2 次，取均值与定值比较，求偏倚，评价E3的正确度。

1.3.3 精密度评价：参照CLSI EP15-A文件[4]，验证批内及批间精密度。批内精密度：同一天内分别同时分析低、高两水平E3样本，每个水平重复检测20 次。收集实验数据进行统计分析，以变异系数（CV）不超过1/4 TEa，即6.25%为合格标准。批间精密度：高、低两个不同浓度的尿液样本，每天一个批次分别重复检测4 次，连续检测5 d。收集实验数据进行批间精密度分析。

1.3.4 线性试验评价：参照CLSI EP6-A文件[5]并稍作调整，选择一份E3低浓度混合尿液（L）和一份E3高浓度混合尿液（H），按照体积比：L、4L＋1H、3L＋2H、2L＋3H、1L＋4H、H，配制成6个系列浓度的混合尿液。预期浓度计算公式为：C＝(CH×VH＋CL×VL)/(VL＋VH)，其中C为浓度，V为体积。每个浓度检测2 次，所有实验在1 d内完成，收集实验数据进行统计分析。

1.3.5 可报告范围验证：选择患者高值新鲜尿液，根据检测系统说明书使用适用的稀释液按比例稀释，稀释比例按照检测系统性能确定。将高值样品用生理盐水作1:2、1:5稀释，每个稀释样品至少重复检测2 次，以均值表示各个稀释的样品检测值。比较各个稀释度样品的检测值和预期值，并分别计算回收率。

1.3.6 参考范围验证：选取不同中晚期孕周的表观健康孕妇24 h尿液作为评价样本，每组20 例。每个分组数据中，数据中至少有18/20个分布于引用的参考区间之内，可认为引用参考区间适合本实验室。

1.4 统计学分析 本文所用统计量及统计图表均由MedCalc分析软件计算绘制。

2 结果

2.1 正确度试验 所测各不同浓度的校准品，其偏倚百分比均小于允许偏倚12.5%（1/2 TEa），正确度验证实验通过。结果详见表1。

表1 E3正确度试验

2.2 精密度试验 E3低（水平1）、高（水平2）浓度混合尿液的精密度试验结果见表2 。各浓度水平E3的批内精密度均＜6.25%（1/4 TEa），实验通过；批间精密度均符合厂商声明标准。

表2 E3精密度试验

2.3 线性试验 E3各浓度的测得值与预期值无显著差异，绘制散点图无离群值点。6 例梯度浓度标本的平均偏倚百分比－0.055%（－5.67%, 2.58%），小于允许偏倚（±12.5%）。线性回归方程：Y＝1.0034X－1.7311，R2＝0.9955。E3在18.0～300.0 ng/mL浓度范围内呈线性。见图1。

图1 测定值与理论值线性回归

2.4 可报告范围验证 在稀释100～1 000倍后，其结果回收率在80%～120%，故可接受的最大稀释度1:1 000，分析测量范围上限300 ng/mL，临床可报告范围为300 000 ng/mL，可满足所有标本的检测需求。

2.5 参考范围验证 在32～33 孕周，引用尿液E3参考区间9.32～20.53 mg/24 h，该组20 例健康孕妇的尿液E3结果全部在引用范围内；在引用的36～37 孕周E3参考区间16.28～27.53 mg/24 h，19例符合（19/20）；在39～40 孕周，引用参考区间22.13～32.32 mg/24 h，19 例符合（19/20）。实验结果证明，该分组参考区间可应用于本实验室。

3 讨论

孕妇尿液E3检测是反映胎儿、胎盘和母体机能的重要指标。可了解胎盘功能及胎儿的发育情况，及早发现异常妊娠，监测妊娠糖尿病、妊娠高血压综合征患者的妊娠状况[2]。

均相酶法具有灵敏度高、特异性强、反应时间短、性价比高，可自动化定量检测等优点[6-7]。本研究评估的均相酶法检测E3方法学原理，是基于液相均相体系的竞争结合。液体样本中的游离E3与葡萄糖六磷酸脱氢酶-雌三醇偶联物竞争结合抗雌三醇抗体位点。样本中的游离E3越多，竞争结合抗体位点越多，抗体释放出的酶标偶联物就越多。游离出的雌三醇酶标偶联物催化β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型（NAD+）转化为β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型（NADH），样本中E3浓度与NADH生成量成正比，通过340 nm吸光值变化即可计算出E3含量。本研究对均相酶法检测E3进行验证，结果显示，在正确度、精密度、线性范围等主要性能指标上，均符合厂商声明或“临床生物化学检验常规项目分析质量指标”（WS/T 403－2012）[8]，可满足临床实验室要求。

在中晚期不同孕周孕妇尿液的参考区间验证中，结果显示，该参考区间可在本实验室采用。但考虑到24 h尿液留取，孕妇依从性差，我们已进行孕妇随机尿液E3参考值区间的建立，其临床实用性还需大样本进一步证实。