维生素D对复发性流产患者早孕期蜕膜基质细胞分泌白细胞介素17、23水平的影响▲

李 宁 毛惠宁 丘 映 史秋雯 周英惠 李慕军

(1 广西医科大学第三附属医院生殖医学中心，南宁市 530031，电子邮箱：747190546@qq.com；2 广西南宁市上林县人民医院妇科，南宁市 530500；3 广西中医药大学附属瑞康医院妇科，南宁市 530011；4 广西医科大学第一附属医院生殖医学中心，南宁市 530021)

复发性流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)病因复杂，约有50%以上的RSA患者发病原因不明，称为不明原因复发性自然流产(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)[1]。目前，研究已证实免疫失衡在RSA发病过程中发挥重要作用，其中白细胞介素(interleukin，IL)-23/IL-17炎症轴通路与RSA的免疫紊乱机制有关[2]。近年来，维生素D的免疫调节作用是国内外研究的新方向。研究表明维生素D能通过多种途径抑制IL-17的产生，并在器官移植、类风湿性关节炎、哮喘等自身免疫性疾病中取得了较好的治疗效果[3]。此外，维生素D在女性生殖和妊娠过程中也发挥重要作用，RSA患者血浆维生素D水平低于正常妊娠者[4]。但维生素D是如何参与正常和异常的生殖和妊娠过程，机制仍不清楚。蜕膜基质细胞(decidual stromal cell，DSC)是母-胎界面非常重要的细胞组成成分，早孕期的DSC既能营养胚胎，又参与滋养细胞的分化、迁移过程，还具有免疫调节作用[5]。然而，目前关于DSC的研究相对较少，尤其是维生素D是否影响人类妊娠早期DSC的IL-17、IL-23分泌水平，未见相关报道。本研究通过分离培养RSA患者早孕期DSC，分析DSC分泌IL-17、IL-23的水平以及维生素D在其中的影响，探讨维生素D治疗RSA的作用机制。

1 资料和方法

1.1 临床资料 选取2016年4月至2016年11月在广西医科大学第一附属医院就诊的5例妊娠6～8周RSA患者，年龄(30.60±3.08)岁；另选择同期因计划外妊娠行人工流产的5例正常妊娠妇女，年龄(29.00±4.03)岁。纳入标准：(1)RSA患者，流产次数均≥2次，本次和既往妊娠期间行B超动态监测未见胚胎心管搏动或者胎心搏动停止；(2)正常妊娠妇女，既往均无不良孕产史，本次妊娠期间无腹痛、阴道流血等先兆流产的症状和体征，经B超检查明确宫内活胎妊娠。排除标准：(1)RSA患者，夫妻双方任意一方染色体异常；(2)两组研究对象均排除生殖道发育畸形、感染性疾病、内分泌疾病、自身免疫性疾病等患者。所有研究对象均签署知情同意书，本研究经广西医科大学第一附属医院伦理委员会批准。

1.2 实验设备和试剂 荧光显微镜(日本Olympus公司，型号：BX63) ，全自动酶标仪(美国BioTek公司，型号：ELx800)，Ⅳ型胶原酶(美国Sigma公司，批号：WXBC0544V)，IL-17和IL-23酶联免疫吸附测定试剂盒(武汉华美生物科技有限公司，批号：CSB-E12819h、CSB-E08461h)，Percoll细胞分离液(北京索莱宝生物科技有限公司，批号：417E1046)，1,25-二羟维生素D3[1,25-dihydroxyvitamin D3，1,25-(OH)2D3](美国Sigma公司，批号：96M4039V)，鼠抗人波形蛋白单克隆抗体(福州迈新生物技术开发公司，批号：MAB-0735)，鼠抗人角蛋白-7单克隆抗体(福州迈新生物技术开发公司，批号：MAB-0828)，即用型免疫组化超敏检测试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司，批号：KIT-9710)。

1.3 方法

1.3.1 取材：在人工流产术后，将无菌吸出的组织全部倒入无菌碗中，通过肉眼观察分离出绒毛和蜕膜组织；再用无菌纱布吸去蜕膜组织的血液后，装入含1%双抗的杜氏改良伊格尔培养基/F12完全培养基(美国Gibco公司，批号：R10-092-CV)的无菌试管中，于1 h内带回实验室超净台，进行原代细胞分离及培养。整个取材过程遵循无菌操作原则。

1.3.2 DSC的分离：采用酶消化法结合梯度离心法的方法[3]进行DSC分离纯化。蜕膜组织经过Ⅳ型胶原酶消化成单细胞后，先分别用不同规格网筛(100、200、400目)滤去其中体积较大的腺上皮细胞，然后用Percoll梯度离心法分离出不同密度的DSC和蜕膜免疫细胞，再根据两种细胞的贴壁性不同，37℃、5% CO2条件下培养30 min后即得到纯化的DSC，显微镜下观察细胞形态并进行细胞计数。

1.3.3 DSC的免疫细胞化学鉴定：在预先放置有经TC处理的细胞爬片的6孔板中，加入上述新鲜分离的DSC(2×106个)，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养48 h后，用磷酸缓冲盐溶液洗涤细胞3次，2 min/次。用4%多聚甲醛固定细胞20 min后，再用磷酸缓冲盐溶液洗涤细胞3次，2 min/次。加入0.3%聚乙二醇辛基苯基醚0.2 mL以增加细胞膜通透性。加入3%过氧化氢1 mL，室温孵育15 min，以去除其中内源性过氧化物酶活性。加入1%胎牛血清1 mL封闭细胞15 min。去除封闭液后，加入抗人波形蛋白抗体(1 ∶100)、抗人角蛋白-7抗体(1 ∶100)，4℃孵育过夜。次日，依次加入即用型免疫组化超敏检测试剂盒的生物素化的二抗、辣根过氧化物酶标记的亲和素化的生物素反应试剂，37℃孵育20 min；滴加二氨基联苯胺工作液，避光显色。苏木素轻度复染，自来水冲洗后脱水、透明，中性树胶封片。在Olympus倒置显微镜下观察，爬片中见黄褐色颗粒出现即为阳性表达。实验重复5次。

1.3.4 DSC的分组培养： 收集贴壁细胞重悬于杜氏改良伊格尔培养基/F12完全培养基中，调整细胞浓度为5×105/mL。正常妊娠妇女的DSC加入溶媒无水乙醇(对照组)，RSA患者的DSC分为等量的两部分：一部分加入溶媒无水乙醇(RSA组)、另一部分加入以无水乙醇为溶媒、浓度为10-7mol/L的1,25-(OH)2D3(RSA+VD组)，均培养24 h后收集细胞培养上清，分装冻存于-80℃冰箱，备用于酶联免疫吸附测定实验。

1.3.5 IL-17、IL-23水平检测：取细胞培养上清液检测IL-17和IL-23水平，所有步骤均按照酶联免疫吸附测定试剂盒说明书完成。

1.4 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 DSC的免疫细胞化学鉴定 新鲜分离的DSC呈圆形，在培养30 min后即可牢固地贴壁生长，24 h后细胞形态呈梭形或不规则形。DSC经免疫细胞化学鉴定，波形蛋白阳性，角蛋白-7阴性(见图1)，纯度接近100%。重复5次结果均一致，经此方法分离纯化的DSC可用于后续实验。

波形蛋白阳性 角蛋白-7阴性图1 人早孕DSC的免疫细胞化学鉴定(×200)

2.2 3组DSC中IL-17、IL-23水平 3组DSC分泌IL-17水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)，其中RSA组DSC分泌IL-17水平高于对照组和RSA+VD组(均P<0.05)，见表1。由于DSC细胞培养上清中IL-23表达水平较低，3组均超过了试剂盒的检测下限，因此未能比较各组DSC细胞分泌IL-23的变化。

表1 3组DSC分泌IL-17水平(x±s，pg/mL)

注：与RAS组比较，#P<0.05。

3 讨 论

辅助性T细胞17(T helper cell 17，Th17)是近年来RSA领域的研究热点之一，IL-23/IL-17炎症轴通路是维持Th17活化和功能的关键通路。研究证实，IL-23可通过IL-23/IL-23受体/信号转导和转录激活因子3信号通路来促进Th17的转化[2]。因此，我们推测IL-23/IL-17轴可能是治疗RSA的一个新靶点。目前研究已证实，维生素D能通过多种途径抑制Th17的增殖、分化过程，减少IL-17的产生[3]。然而目前在国内外的文献中，尚无有关维生素D如何参与母-胎界面局部IL-17调节的研究报告。

目前关于妊娠期间细胞因子的研究，多数是母体外周血和母-胎界面各种淋巴细胞的研究，而针对DSC分泌细胞因子的研究还比较少。DSC是一群具有特殊功能的细胞，是构成蜕膜组织的主要细胞成分，约占蜕膜细胞总数的75%。DSC不仅能分泌多种细胞成分，形成细胞外基质，还能分泌多种细胞因子，同时可与蜕膜免疫细胞一起参与母-胎界面的免疫调节，在胚胎的围着床期发挥重要作用[6]。人类早孕期DSC可以分泌IL-β、IL-17、转化生长因子β等多种细胞因子，且研究表明流产者DSC分泌的IL-β、IL-17水平高于正常早孕者[7]。本研究也显示，RSA患者的DSC分泌IL-17水平高于正常孕妇(P<0.05)。由此可见，DSC分泌IL-17水平升高，可能是导致RSA发病的重要机制。

维生素D具有强大的免疫调节作用，在女性生殖和妊娠过程中发挥重要作用。孕妇体内维生素D含量异常与妊娠期糖尿病、子痫前期、早产等多种妊娠期免疫相关性疾病相关[8]。维生素D缺乏与流产的发生具有相关性，孕妇血清中维生素D浓度下降可增加早期自然流产的风险[9]。本课题组前期研究表明，RSA患者蜕膜组织中1，25-二羟基维生素D浓度低于正常早孕者，25-二羟基维生素D水平与IL-23/IL-17炎症轴因子有关，与RSA的发病风险呈负相关[10]。这与 Hou等[4]的研究结果相似，他们发现RSA患者血浆中维生素D浓度下降，且RSA的发病与血浆中维生素D的浓度呈显著负相关。因此，无论是在外周循环还是母-胎界面局部，维生素D水平都与RSA发病有一定的相关性。然而维生素D是通过何种机制参与流产的发病，还需要进一步探讨。

2004年，Bubanovic[11]首次报告了维生素D可作为治疗URSA的一种新型药物。此后，维生素D与RSA等生殖失败相关疾病的关系逐渐受到重视。维生素D不仅能作用于T细胞，对固有免疫细胞也有调节作用，补充维生素D可以通过免疫调节作用，降低自然杀伤细胞的毒性，这可能有利于妊娠的维持[12]。本研究结果显示， RSA+VD组DSC分泌IL-17水平低于RSA组(P<0.05)，说明用维生素D干预，能使RSA患者DSC分泌的IL-17水平明显下降，维生素D可能在DSC活性调节过程中发挥重要作用。

此外，有研究显示，从确认妊娠起，每天对URSA患者经阴道补充400 IU维生素D，至孕20周时患者血清IL-23浓度仅为(18.4±3.78)pg/mL，流产率降低到12.8%，而给予安慰剂治疗的URSA患者血清IL-23浓度则达到(23.16±4.74)pg/mL，流产率为34.2%[13]。由此可见，维生素D可以通过降低血清IL-23水平，改善RSA患者的妊娠结局。而在本研究中，由于DSC细胞培养上清中IL-23表达水平较低，3组均超出试剂盒的检测下限，无法对3组患者IL-23进行比较。这可能与DSC分泌IL-23水平较低有关，在未来的实验研究中，我们将选择灵敏性更高的试剂盒进行验证。

综上所述，RSA患者DSC分泌IL-17水平升高，这可能不利于胚胎着床；维生素D可以抑制DSC分泌IL-17，这或可改变子宫内膜对胚胎的容受性，有利于免疫耐受和胚胎着床、发育。