骨髓间充质干细胞培养液促进STAT3磷酸化诱导Raw264.7细胞向M2型极化

李志伟，周号悦，刘湘粤，何 漪，丁小凤，胡灵玉

(1.湖南师范大学蛋白质化学与发育生物学教育部重点实验室， 长沙 410081;2.湖南省南华生物医药研究所， 长沙 410015； 3.中南大学湘雅三医院， 长沙 410013)

炎症是免疫细胞对病原微生物发生的免疫反应，也是人体对外源性入侵的微生物的一种防御反应。炎症是机体产生免疫反应的一种表现，但炎症对机体的健康会造成伤害。巨噬细胞在炎症发生的过程中，扮演着重要的作用，它是免疫的第二道防线，能够吞噬、杀伤和清除外源性病原微生物。据报道巨噬细胞具有消退炎症、修复组织等功能[1]。巨噬细胞功能的发挥与周围微环境相关，微环境中的细胞因子、微生物等可以导致巨噬细胞向不同的方向极化，从而发挥不同的功能[2]。巨噬细胞的M1型和M2型表型已被公认，M1型和M2型两亚型功能相反，M1型能够产生多种促炎因子，比如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，INOS)，而M2型巨噬细胞则产生多种抑炎因子来缓解炎症[3]。巨噬细胞存在一系列连续的功能状态，M1型和M2型是连续状态的两个极端，在不同条件下，这两种极端可以相互转化[4]。Nahrendor等[5]发现在急性心肌梗死过程中巨噬细胞的M1/M2表型会转化。

骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BMSC)是从骨髓中提取的一类间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)。间充质干细胞是一种具有分化能力的多能干细胞，能够分化为骨、软骨、脂肪、肌肉等多种组织细胞，同时具有促进伤口愈合与再生的能力[6]。它主要来源于脐带、脂肪、骨髓等[7]。间充质干细胞具有低免疫原性，对机体中的免疫细胞具有重要的免疫调控作用[8,9]。有研究证实，MSCs主要通过影响参与炎症反应的免疫细胞增殖、分化和炎性因子分泌来进行免疫调控[10,11]，但是其免疫调控机制复杂，尚未完全明确。因此探究间充质干细胞对巨噬细胞的影响，是否能促进巨噬细胞向分泌抑炎因子的M2型极化具有重要的研究意义。本研究利用培养小鼠骨髓间充质干细胞培养液(bone marrow-derived mesenchymal stem cell culture medium，BMSC-CM)处理M1型巨噬细胞Raw264.7，探究BMSC-CM对巨噬细胞Raw264.7表型极化的影响以及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

3周龄C57BL/6小鼠购自湖南斯莱克景达公司。DMEM(dulbecco’s modified eagle medium)培养基、DMEM/F12[dulbecco’s modified eagle medium nutrient mixture F-12(Ham)]培养基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、胰酶、青霉素和链霉素双抗均来自Gibco公司(Gibco，USA)。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)来自Sigma-Aldrich公司(Sigma-Aldrich，USA)。RNA提取试剂Trizol(Takara，Japan)，反转录试剂盒GoScriptTMReverse Transcription System(Promega，USA)，氯仿(泸试试剂，上海)，异丙醇和乙醇来自恒兴试剂公司(恒兴试剂，天津)，1.1×T3 Super PCR Mix试剂、琼脂糖和引物均购自擎科生物公司(擎科生物，北京)。细胞裂解液RIPA试剂(碧云天，上海)，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)和蛋白质定量BCA试剂盒来自生工生物公司(生工生物，上海)。蛋白免疫印迹所用的抗体包括：anti-STAT3 兔单克隆抗体(生工试剂，上海)；anti-tubulin兔单克隆抗体(Sigma-Aldrich，USA)；anti-p-STAT3兔单克隆抗体(Cell Signaling Technology，USA)；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(Abmart，UAS)；化学发光ECL试剂(Advansta，USA)。

1.2 骨髓间充质干细胞的提取及培养

骨髓间充质干细胞提取参考Zhu等[12]的方法，稍有改进。选取雌雄不限的3周龄C57BL/6小鼠，颈 椎脱臼法处死；用75%酒精浸泡处死的小鼠1 min，取小鼠股骨和胫骨放置在盛有预冷的PBS的培养皿中，用PBS清洗股骨与胫骨2次，洗去附着在上面的小块的肌肉组织；将股骨与胫骨的两侧骨端剪去，用1 mL的注射器吸入含有10%FBS的DMEM/F12培养液，从股骨或胫骨的一侧打出至培养皿中，重复冲洗直至股骨或胫骨发白；收集冲洗的培养液,3 048 r/min离心5 min，弃掉上清液，用含10%FBS的DMEM/F12培养液重悬，放置在37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。此后每间隔8 h，更换培养液，此步骤重复3次，此步骤是将造血干细胞、红细胞等悬浮的细胞去除得到纯的骨髓间充质干细胞。常规培养至细胞达到80%～90%融合时进行传代。

1.3 骨髓间充质干细胞培养液(BMSC-CM)的制备

骨髓间充质干细胞传代至第2、3代，当细胞达到80%～90%融合时，使用DMEM培养液培养，24 h后吸取培养液，16 697 r/min离心10 min，取上清液，保存于-20 ℃，细胞常规传代。

1.4 Raw264.7细胞的培养及处理

Raw264.7细胞为本实验室冻存，使用含10%胎牛血清的DMEM培养液常规传代培养。试验分为DMEM培养组(DMEM组)、BMSC-CM培养组(BMSC-CM组)、LPS刺激DMEM培养组(LPS+DMEM组)、LPS刺激BMSC-CM培养组(LPS+BMSC-CM组)。当Raw264.7细胞融合至50%时，DMEM组和BMSC-CM组常规换液，LPS+DMEM组和LPS+BMSC-CM组更换添加1 μg/mL LPS的DMEM培养液培养；12 h后，DMEM组和LPS+DMEM组更换DMEM培养液培养，BMSC-CM组和LPS+BMSC-CM组更换含50%BMSC-CM的DMEM培养液培养。培养48 h，提取总RNA进行半定量PCR，提取总蛋白进行Western 蛋白质印迹试验。

1.5 RNA提取以及半定量PCR

按1.4的步骤处理的Raw264.7细胞，采用Trizol试剂提取各组的RNA。首先将各组细胞用PBS清洗1遍，再加入1 mL Trizol裂解细胞，加入250 μL氯仿后充分震荡并静置5 min；4 ℃、11 807 r/min离心10 min，收集上清液加入350 μL异丙醇，室温静置10 min后，在4 ℃下11 807 r/min离心10 min，弃上清并用1 mL预冷的75%乙醇充分洗涤沉淀，离心去掉乙醇；待乙醇挥发后，用RNase free水溶解RNA，测定在260和280 nm的吸光值(A)，以A260/A280确定RNA浓度，比值在1.8～2.0内。按照GoScriptTMReverse Transcription System试剂盒操作说明书进行逆转录，合成cDNA链，以2 μg的RNA为模板，逆转录反应体系为:20 μL，扩增程序为25 ℃，5 min；42 ℃，1 h；70 ℃，15 min。得到的cDNA用灭菌水稀释5倍作为半定量PCR的模板。使用1.1×T3 Super PCR Mix试剂进行半定量PCR，半定量PCR扩增程序为：预变性98 ℃ 5 min；PCR反应98 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，共28个循环。最后取20 μL PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，以小鼠GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,甘油醛-3-磷酸脱氢酶)mRNA作为内参，计算样品的mRNA相对表达量。PCR引物序列见表1。

表1 PCR引物序列Tab.1 Primer sequence for PCR

1.6 蛋白提取及Western蛋白质印迹检测

按1.4的步骤处理的Raw264.7细胞，去掉细胞培养液，收集用胰蛋白酶消化后的细胞，用PBS清洗3次，加入RIPA试剂提取总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度。加入蛋白上样缓冲液后105 ℃变性10 min，制备12%聚丙烯酰胺胶，取40 μg蛋白上样电泳。湿法电转移80 min，5%脱脂牛奶TBST封闭后，孵育稀释的一抗：anti-tubulin兔单克隆抗体(1∶5 000)、anti-STAT3 兔单克隆抗体(1∶500)、anti-p-STAT3兔单克隆抗体(1∶1 000)，4 ℃轻微摇晃过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，室温孵育辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶5 000)1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加入ECL试剂显影。

1.7 统计学方法

试验数据采用SPSS 25统计软件进行统计分析。数据分析采用Student’st-test检测。误差线表示3个独立的平均值的标准差，*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001;****P<0.000 1。

2 结果与分析

2.1 骨髓间充质干细胞原代细胞形态学观察

重悬细胞培养24 h对细胞进行换液后，如图1所示，在显微镜下观察可见细胞贴壁生长，多数细胞呈圆形，部分呈不规则形状；培养至第4 d时，显微镜视野下细胞之间间隙较宽，细胞摊开伸出伪足向梭形形状生长；培养至第7 d时，细胞大多数呈梭形，且细胞开始聚集；培养至第10 d时，细胞呈梭形且形态均一，细胞聚集呈漩涡状。第一代细胞细长呈长梭形，胞体小，并且伪足较少；第五代和第十代的细胞形态、细胞大小、伪足数量和第一代比较无明显变化，细胞均呈梭形，汇合时呈漩涡状，细胞活力高，增殖速度较快。

图1 骨髓间充质干细胞各时期细胞形态(比例尺1∶400 μm，×10)Fig.1 Cell morphology of bone marrow mesenchymal stem cells at various stages (scale 1∶400 μm，×10)(a)24 h；(b)第4天；(c)第7天；(d)第一代；(e)第五代；(f)第十代(a)24 h;(b)4 d;(c)7 d;(d)The first generation;(e)The fifth generation;(f)The tenth generation

2.2 MSC-CM对LPS诱导的Raw264.7细胞分型相关标记分子mRNA相对表达量的影响

根据文献报道，巨噬细胞M1型和M2型的分型可以通过检测相关标志因子的表达来区分，M1型的促炎因子TNF-α和INOS表达较高，而M2型的抑炎因子精氨酸1(arginase 1，ARG-1)和转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)表达较高[13]。如图2所示，MSC-CM组和LPS+MSC-CM组M1型的相关标记分子TNF-α和INOSmRNA表达比DMEM组和LPS+DMEM组明显下降，而且这两组M2型的相关标记分子ARG-1和TGF-β1mRNA表达比DMEM组和LPS+DMEM组明显上升。从检测标志基因mRNA水平上可以说明，LPS组巨噬细胞处于M1型状态，而MSC-CM处理的Raw264.7细胞由M1型向M2型状态极化。

图2 M1型和M2型相关标志因子mRNA表达水平Fig.2 M1 and M2 related marker factor mRNA expression levels(a)半定量PCR检测TNF-α, INOS, ARG-1和TGF-β1 mRNA表达水平；(b)对a图的数据统计分析。星号示差异有统计学意义(*P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001)(a)Detection of TNF-α, INOS, ARG-1 and TGF-β1 mRNA expression levels by semi-quantitative PCR;(b)Statistical analysis of the data of the Fig.a. The asterisks indicate a statistically significant difference (*P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001)

2.3 MSC-CM对LPS诱导的Raw264.7细胞IL-10 mRNA水平以及STAT3和p-STAT3蛋白表达的影响

由2.2的结果可以发现MSC-CM可以诱导Raw264.7向M2型极化的现象，进一步探究这一现象的具体分子机制。查阅文献得知M2型巨噬细胞可高分泌IL-4和IL-10等细胞因子[14,15]，因此推测可能与IL-10/STAT3信号通路有关。半定量PCR检测IL-10mRNA水平和Western blot检测p-STAT3和STAT3蛋白水平，结果如图3所示，两组MSC-CM处理的Raw264.7的IL-10mRNA水平相对比其他两组表达明显上升。而p-STAT3蛋白水平的趋势与IL-10mRNA水平趋势一致，使用MSC-CM培养处理的细胞p-STAT3蛋白表达比LPS/DMEM组明显上调，各组的STAT3蛋白无明显变化。试验结果说明，MSC-CM诱导Raw264.7向M2型极化的分子机制是通过促进STAT3磷酸化来激活IL-10/STAT3信号通路的进行。

图3 检测STAT3和p-STAT3蛋白表达水平和 IL-10 mRNA表达水平Fig.3 Detection of STAT3 and p-STAT3 protein expression levels and IL-10 mRNA expression levels(a)蛋白免疫印迹检测STAT3和p-STAT3蛋白水平。星号示差异有统计学意义(*P<0.05，** P<0.01，**** P<0.000 1)；(b)半定量PCR检测IL-10 mRNA水平。星号示差异有统计学意义(*P<0.05，** P<0.01)(a)Western blotting detects STAT3 and p-STAT3 protein levels. The asterisks indicate a statistically significant difference (*P<0.05, ** P<0.01,**** P<0.000 1);(b)Semi-quantitative PCR detects IL-10 mRNA levels. The asterisks indicate a statistically significant difference (*P<0.05, ** P<0.01)

3 讨论

间充质干细胞是一种具有自我更新和分化能力的多能干细胞，它易获取，增殖能力强，具有免疫抑制作用[16]。因此MSC是细胞治疗中一种非常有吸引力的载体[10]。MSC可以从多种组织中分离出来，比如脐带、脂肪和骨髓，但与其他组织来源获取MSC相比,从骨髓中分离操作相对简单，且易获取大量MSC[6]。小鼠作为模式生物之一，它与人类具有高度的同源性，因此从小鼠骨髓中获取MSC是研究BMSC功能性有效的细胞模型。MSC细胞治疗的难度在于如何在体外培养维持MSC活性和干细胞功能性[17]。MSC在出现衰老时，其代谢特征将会改变[18,19]。BMSC衰老过程中的遗传损伤会随之积累，这将减弱干细胞的可用性和功能[20]。因此，BMSC的活性维持和扩增后干细胞功能性保持是研究BMSC的基础。目前文献报道小鼠BMSC大多数是来源4～8周龄小鼠，随着小鼠的生长发育，体内的干细胞分化能力和活力将会随之发生改变。随着鼠龄增大，其来源的BMSC活力和分化能力将会下降。本研究采用3周龄C57BL/6鼠为试验对象，3周龄的C57BL/6鼠处于刚断奶状态，其发育不齐全，且体型偏小，利用这些特点很容易提取活力强的BMSC。在之后的研究中发现，正常培养BMSC能够扩增至十代，且细胞形态、大小不发生改变，其促进STAT3磷酸化诱导Raw264.7细胞向M2型极化的生物功能也不会发生改变。由此可知，通过本研究中提取BMSC的方法能够有效维持BMSC活性以及干细胞功能。

巨噬细胞在淋巴组织和非淋巴组织中都存在，被认为其通过清除凋亡细胞和分泌生长因子维持稳态[21]。巨噬细胞具有病原体识别受体，能够有效吞噬病原体并能诱导产生炎性因子参与免疫反应[1,22]。有关研究表明，巨噬细胞存在一系列连续的功能状态，M1型和M2型是连续状态的两个极端[3]。通常认为M1型巨噬细胞分泌促炎性细胞因子和趋化因子，在免疫反应中提呈抗原和吞噬病原体，从而引发炎症；M2型巨噬细胞通过分泌抑制性细胞因子TGF-β和IL-10等下调免疫应答，起到抑制炎症的作用[23]。M1型巨噬细胞表达TNF-α和INOS比M2型明显升高，而M2型巨噬细胞ARG-1的表达水平比M1型显著提高[14,15]，因此检测巨噬细胞相关标记可以鉴定巨噬细胞的状态。本研究中利用LPS诱导巨噬细胞Raw264.7，检测巨噬细胞TNF-α和INOS标志因子，结果显示TNF-α和INOSmRNA表达上升，表明巨噬细胞处于能够导致炎症发生的M1型，再用BMSC-CM处理巨噬细胞，研究BMSC-CM是否能够抑制炎症，结果表明，使用BMSC-CM处理的巨噬细胞的ARG-1和TGF-β表达上升，表明巨噬细胞处于M2型。

有关文献报道STAT3是调节抗炎因子IL-10的转录因子，在抑制炎症反应过程中发挥很重要的调控作用[24,25]。STAT3属于STAT家族中一员[26]，而JAK-STAT信号通路是由细胞因子调控激活的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、免疫以及凋亡等生物学过程[27,28]。研究表明，一类细胞因子可以调控多种JAK激酶，但是细胞因子对STAT家族蛋白的激活具有特异性，例如IL-1选择性激活STAT-1，IL-4特异性激活STAT-6，IL-10特异性激活STAT-3[29]。我们查阅大量文献，最终推测BMSC-CM对Raw264.7向M2型极化可能是通过IL-10/STAT-3通路诱导的。我们半定量PCR检测对照组和试验组的IL-10mRNA水平，结果显示BMSC-CM处理的Raw264.7的IL-10表达上升；根据这一结果，我们检测了各组的p-STAT3蛋白水平，结果显示BMSC-CM可以上调p-STAT3，对STAT3的影响没有明显的调控作用。这与之前检测M1型和M2型巨噬细胞的标志因子结果相对应，因此可以说明BMSC-CM主要是通过激活STAT3磷酸化参与IL-10/STAT3通路诱导巨噬细胞Raw264.7细胞向M2型极化，从而发挥抑制炎症的功能。

综上所述，从3周龄C57BL/6鼠的骨髓中分离的BMSC活性较好,而且能够持续十代维持其干细胞功能，提取培养BMSC的上清液处理由LPS诱导的M1型Raw264.7细胞，试验证明，BMSC-CM能够有效缓解炎症的发生，主要是促进STAT3磷酸化通过IL-10/STAT3信号通路来诱导M1型巨噬细胞向M2型极化，从而达到抑制炎症的效果。但进一步思考可发现BMSC能够分泌许多类型的细胞因子，具体哪种细胞因子促进STAT3磷酸化暂时还没有得到结论，因此从BMSC分泌的细胞因子中筛选出有效抑制炎症的细胞因子，再体外培养能够大量分泌该种细胞因子的BMSC，这将是一个更有意义、更有趣的研究。