细颗粒物PM2.5对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化的影响及机制

赵 培，谭 鹤，彭克楠，李新新，马 倩，霍丽静，张明明，路永刚，帖彦清

(河北省人民医院检验科，石家庄 050051)

PM2.5是指悬浮在大气中空气动力学直径≤2.5μm的颗粒物，主要来源于燃料燃烧、机动车尾气和道路扬尘等。石家庄市空气污染严重，特别是PM2.5颗粒物重金属含量高。研究发现PM2.5能避开呼吸系统屏障直接进入血液循环，改变白细胞功能，引起氧化应激和炎症反应[1]。动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，被认为是心血管疾病的主要病理学基础[2]。多项流行病学研究显示急性或长期暴露于PM2.5能显著升高人群心血管事件发生和死亡的风险[3-4]。那么PM2.5能否引起ApoE-/-小鼠(As模型小鼠)血清及斑块中炎症因子及氧化应激的表达，改变小鼠心脏功能并加速动脉粥样硬化的发生发展呢?本实验采用PM2.5干预ApoE-/-小鼠(As模型小鼠)，通过超声心动图评价小鼠心脏功能；通过测定血清中以及降主动脉中的炎性因子水平来评价PM2.5对ApoE-/-小鼠的炎症反应的影响；通过测定降主动脉中NAD(P)H氧化酶亚单位p22phox和p47phox的水平来评价PM2.5对ApoE-/-小鼠的氧化应激的影响。通过降支全动脉油红O染色、主动脉根部MOVAT染色评估PM2.5干预对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化形成的影响。本实验就PM2.5暴露诱发ApoE-/-小鼠的炎症反应和氧化应激从而促进其动脉粥样硬化发生发展的深层机制进行初步探讨，为积极应对PM2.5诱发心血管疾病的相关研究工作提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

32只八周龄的雄性SPF级ApoE-/-小鼠(体重为20～22 g)，购自卡文斯实验动物有限公司[SCXK(苏)2016-0010]，饲养于河北省人民医院临床研究中心SPF级动物房，每笼5～6只。所有小鼠在20℃～24℃和45%～55%湿度条件下，以12 h的明暗循环用高脂饮食喂养8周(含21%脂肪、19.5%酪蛋白和1.25%胆固醇)，动物实验在河北省人民医院实验动物中心[SYXK(冀)2015-0065]进行，该动物实验经过了河北省人民医院医学伦理委员会的批准(201922)并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.1.2 实验材料

细颗粒物(PM2.5)由河北省疾病预防控制中心通过TH-150D型智能中流量空气总悬浮颗粒物采样器进行24 h连续中流量采样收集。收集PM2.5于内置石英纤维滤膜上，每天更换一张滤膜，阴雨天气不采样。将PM2.5滤膜称重并溶解于生理盐水中，然后超声波处理30 min，以分散颗粒，最后用液氮冷冻干燥，并在黑暗中4℃下储存[5]。

1.2 主要试剂与仪器

药品与试剂:高脂饲料(江苏美迪森生物医药有限公司)；油红O和MOVAT染液(Sigma Aldrich公司)；血糖、血脂(TC、TG、LDL-C)(贝克曼公司)；引物(英潍捷基贸易有限公司)，逆转录试剂盒(RR047 A，宝生物公司)，荧光定量检测试剂盒(RR820 A，宝生物公司)。仪器:全自动生化分析仪(贝克曼5821)，石蜡切片机(德国Leica公司)，多用途低温离心机(Eppendorf公司)，正置显微镜(德国Carl Zeiss公司)，体视显微镜(德国Leica公司)，Epoch CHS酶标仪(美国BioTek公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组与造模处理

将ApoE-/-小鼠随机分为PM2.5组(n＝16)和对照组(n＝16)，每天将10 mg的PM2.5粉末悬浮在4.8 mL的生理盐水中，PM2.5组每只小鼠每天气管滴注0.3 mL PM2.5混悬液一次，对照组滴注相同剂量的生理盐水。小鼠PM2.5用量是参考石家庄地区正常成人每天PM2.5吸入量(2017年石家庄平均PM2.5为65μg/m3)，所有动物的操作均符合河北省人民医院动物伦理委员会和NIH实验动物护理和使用指南。

1.3.2 小鼠超声心动图和血流动力学测量

实验结束时，小鼠经1%的异氟醚麻醉后使用配有30 MHz高频探头的Visual Sonic Vevo 770型超声仪(VisualSonics，Toronto，Canada)沿仰卧小鼠胸骨旁左室乳头肌水平短轴和长轴切面采集左室图像，同时在二维图像引导下分别获取5个以上连续心动周期M型超声影像并记录以下参数:射血分数(LV ejection fractions，EF)，左室缩短分数(fractional shortening，FS)，左室收缩末期内径(left ventricular end systolic dimension，LVESd)，左室舒张末期内径(left ventricular end diastolic dimension，LVEDd)，左室舒张末期后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness at end diastolic stage，LVPWd)和左室舒张末期前壁厚度(left ventricular anterior wall thickness at end diastolic stage，LVAWd)，并比较两组小鼠以上数据的差异。

1.3.3 小鼠全血重金属测定

小鼠取血，采用质量浓度为10 mg/L的铝、钒、铁、锰、硒、银等微量重金属(Agilent科技公司，美国)的标准溶液配制各种质量浓度为0.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00和200.00μg/L的溶液，并建立标准曲线，电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS，Thermo Fisher Scientific，Massachusetts，USA)测定全血的重金属含量，同时测定小鼠所用的PM2.5混悬液的重金属含量。

1.3.4 小鼠血糖、血脂、IL-6和TNF-α水平的测定

小鼠取血后离心获得血清，全自动生化分析仪检测血清葡萄糖(GLU)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的水平，ELISA方法测定血清IL-6和TNF-α水平。

1.3.5 小鼠动脉斑块面积评估

评估整个动脉的脂质沉积情况，从左锁骨下动脉到髂骨分叉处解剖主动脉油红O染色。以油红O阳性面积/血管总面积×100%评估主动脉整体斑块大小。主动脉根部行石蜡切片，参照文献行Movat染色[6]，评估动脉斑块大小，数据通过Image Pro PluS-6软件(Media Cybernetics，Inc.)进行分析。

1.3.6 小鼠降主动脉斑块内部相关基因检测

使用TRIzol两步法抽提降主动脉的总RNA，按照逆转录试剂说明书进行实时荧光定量PCR。20 μL逆转录反应体系中，总RNA加样量在约500 ng；得到的cDNA用无酶水稀释5倍，-80℃冰箱保存备用。斑块内部相关因子及内参基因荧光定量PCR反应引物序列，见表1。

1.4 统计学方法

所有数据采用SPSS 17.0统计软件进行分析。计量资料以平均数±标准差(±s)表示，各组间数据的比较依据资料的性质采用t检验或方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠超声心动图

定量分析表明，两组间EF、FS、LVESd、LVEDd、LVPWD和LVAWD等数据差异无显著性，PM2.5未能影响心脏功能(见图1、表2)。

表1 基因引物序列Table 1 Realtime quantitative PCR gene primers

表2 对照组及PM2.5组ApoE-/-小鼠心脏功能的比较Table 2 Comparison of cardiac function between the control group and PM2.5 group

2.2 小鼠血液中重金属含量测定

采用电感耦合等离子体质谱法测定PM2.5混悬液及两组小鼠血液中重金属含量，我们发现PM2.5组(表3)全血中重金属含量显著升高，特别是铝、钒和铁，且PM2.5组小鼠的全血重金属比例与PM2.5混悬液相似(表4)。这些数据表明PM2.5重金属颗粒可以通过气管滴注法进入ApoE-/-小鼠循环系统。

2.3 小鼠血糖、血脂以及促炎因子水平的检测

PM2.5组和对照组小鼠血清的GLU、CHOL、TG、LDL-C和HDL-C水平无显著差异(图2A)。然而，经PM2.5处理的ApoE-/-小鼠表现出较高的血清促炎因子(IL-6、TNF-α)表达水平(图2B、2C)。

2.4 小鼠动脉粥样硬化斑块面积评估

采用定量形态学方法测量了从主动脉弓到髂总动脉分叉处的全降主动脉油红O染色标本，以代表动脉粥样硬化斑块所占区域。与对照组相比经PM2.5处理的ApoE-/-小鼠主动脉斑块面积的百分比较高(*P＝0.0276)。主动脉根部切成5μm的石蜡切片进行Movat染色，显示PM2.5组主动脉根部斑块面积显著增加(*P＝0.0231)，见图3。

2.5 降主动脉斑块内部炎症和氧化应激相关基因表达

我们发现经PM2.5处理后的ApoE-/-小鼠降主动脉斑块内经典的促炎细胞因子IL-6、TNF-α、Lp-PLA2以及NAD(P)H氧化酶亚单位p22phox和p47phox的表达显著增加(表5)。

注:A:对照组；B:PM2.5组。图1 PM2.5对ApoE-/-小鼠超声心动图检测的心功能影响Note.A，Control group.B，PM2.5 group.Figure 1 PM2.5 affect cardiac function tested by echocardiographic images in ApoE-/-mice

表3 PM2.5组小鼠及对照组小鼠血液中重金属含量比较(μg/L)Table 3 Comparison of heavy metal content in blood of PM2.5 group mice and control group mice

表4 PM2.5混悬液重金属的成份和含量(μg/L)Table 4 Composition and content of heavy metals in PM2.5 suspension

注:A:对照组和PM2.5组ApoE-/-小鼠血清炎症因子水平差异无显著性(P＞0.05)；B:PM2.5组ApoE-/-小鼠血清IL-6水平显著升高(*P＜0.05)；C:PM2.5组ApoE-/-小鼠血清TNF-α水平显著升高(*P＜0.05)。图2 PM2.5处理对ApoE-/-小鼠血糖、血脂以及血清炎症因子水平的影响Note.A，There was no significant difference in serum inflammatory factor levels between ApoE-/-mice in the control group and PM2.5 group(P＞0.05).B，Serum IL-6 level of ApoE-/-mice in PM2.5 group was significantly increased(*P＜0.05).C，Serum TNF-αlevel of ApoE-/-mice in PM2.5 group was significantly increased(*P＜0.05).Figure 2 The effect on serum glucose、serum lipids and serum inflammatory factor levels by treatment with PM2.5 in ApoE-/-mice.

注:A:对照组和PM2.5组全降主动脉油红O染色；B:油红O染色显示PM2.5组全降主动脉斑块面积显著增加(*P＝0.0276)；C:PM2.5组和对照组主动脉根部切片MOVAT染色；D:MOVAT染色显示PM2.5组主动脉根部斑块面积显著增加(*P＝0.0231)。图3 PM2.5处理对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块面积的影响Note.A，descending aorta oil red O staining in the control group and PM2.5 group.B，oil red O staining showed a significant increase in the area of aortic plaques in the PM2.5 group(*P＝0.0276).C，MOVAT staining of aortic root sections in PM2.5 group and control group.D，MOVAT staining showed a significant increase in aortic root plaque area in the PM2.5 group(*P＝0.0231).Figure 3 The effect on areas of atherosclerotic lesions by treatment with PM2.5 in ApoE-/-mice

表5 PM2.5对ApoE-/-小鼠斑块内部炎症反应和氧化应激的影响Table 5 The effect on inflammatory factors and Oxidative stress genes by treatment with PM2.5 in ApoE-/-mice

3 讨论

2018年世卫组织公布了最新的全球前十位死亡原因，其中缺血性心脏病和中风高居榜首，而As是这两种疾病的主要病理基础。As是一种在动脉管壁发生的慢性、低水平炎症性疾病，以脂质堆积和纤维斑块形成为特征，血压增高、血脂升高、慢性炎症、氧化应激等因素都会引起As形成与恶化[7]。近年来关于大气污染对As患者的不利影响逐渐引起了人们的重视。研究发现，短期暴露于高浓度或长期暴露于低浓度PM2.5是As进展的一个危险因素[8]。我们的研究发现PM2.5的暴露对超声心动图检测的心功能没有影响(P＞0.05)，同样PM2.5组和对照组在血糖或血脂方面没有显著差异(P＞0.05)，说明短期(8周)暴露于高浓度的PM2.5可能不会对小鼠的心脏功能以及血糖和血脂的水平造成影响。Li等[9]研究发现LDL受体基因敲除小鼠长时间暴露于超细颗粒物会引起小鼠血浆中HDL水平降低，同时甘油三酯水平显著升高。我们的研究结果与其不相同可能与本实验PM2.5暴露时间短有关。

在病理条件下，持续或不受控制的炎症可能导致宿主器官损伤和动脉粥样硬化，导致心肌梗塞和中风[10-11]。氧化应激能够通过直接氧化损伤和间接信号介导损伤促进动脉粥样硬化的发生发展[12]。而炎症反应和氧化应激是PM2.5发挥促动脉粥样硬化作用的重要机制[13]。PM2.5经呼吸进入肺部可直接造成呼吸道上皮氧化损伤和肺组织炎症，导致大量炎性细胞因子进入体循环促发系统性炎症反应[14]。IL-6是由活化的巨噬细胞、上皮细胞以及平滑肌细胞等生成，能促进单核细胞趋化因子蛋白-1的分泌从而促进动脉粥样硬化进程的发展，同时能增加细胞黏附分子的表达，刺激血管平滑肌细胞的增殖与迁移。动脉斑块中存在着大量的巨噬细胞，这些巨噬细胞同样能通过分泌促炎细胞因子(如IL-6、TNF-α等)吸收胆固醇、脂质形成泡沫细胞，引发细胞凋亡等促进As斑块的形成、发展和破裂[15]。脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)是新近发现的AS危险因子，它属于磷脂酶A2超家族，由AS斑块内的巨噬细胞和淋巴细胞等合成，血浆中约有三分之二的Lp-PLA2与含apoB的LDL结合，并被转运至血管内膜的易损区，特异性地剪切内膜下氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)分子中的氧化磷脂，生成促AS的炎性介质-氧化型游离脂肪酸(OX-FA)和溶血卵磷脂(lyso-PC)[16]，这两者能够加快AS斑块发生发展的进程、并促进斑块的坏死和脱落。我们的研究发现PM2.5组ApoE-/-小鼠血清促炎因子(IL-6、TNF-α)水平显著升高(P＜0.05)，这与国内张书余等[17]的研究结果一致，他们的研究发现气管滴入PM2.5悬浮溶液诱发了动脉粥样硬化大鼠IL-6和TNF-α的表达增加；另有药红梅等[18]研究证实，PM2.5尾静脉注射染毒可即使As大鼠血清IL-6，TNF-α，心肌NF-κB活性增加。除此之外我们的研究还发现PM2.5同时诱发了主动脉硬化斑块内IL-6、TNF-α及Lp-PLA2的表达升高(P＜0.05)，这可能是造成PM2.5组斑块面积显著增大的原因之一。

已经证实活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成增多引起的氧化应激参与了多种心血管疾病的发生发展。NADPH氧化酶(NADPH oxidase，Nox)是一类以生成ROS为主要功能的蛋白质，NADPH氧化酶在单核细胞中生成ROS，是导致动脉粥样硬化的重要因素[19]，目前共发现NADPH氧化酶有7种亚型，Nox2是最早发现的Nox亚型，Nox2表达于细胞膜，由胞膜亚基gp91phox、p22phox和胞浆亚基p40phox、p47phox、p67phox、Rac1组成，生理状态下不具有活性，其活化需要胞浆亚基相互结合并转位到细胞膜。越来越多的证据显示，PM2.5能够刺激机体产生氧化应激[20]，Mo等[21]研究发现PM2.5能够通过p38和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)磷酸化，从而活化还原性辅酶II氧化酶(NADPH oxidase)引起内皮细胞内ROS水平的升高，而血管内皮的功能紊乱是动脉粥样硬化发生发展的病理基础之一。我们的研究发现，NAD(P)H氧化酶亚基p22phox和p47phox在PM2.5组ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块中的表达水平显著升高(P＜0.05)。说明PM2.5激活了ApoE-/-小鼠斑块内NADPH氧化酶，NADPH氧化酶的激活或促使单核细胞和内皮细胞中ROS的产生，从而促进动脉粥样硬化斑块的发展。

综上所述，我们的研究发现PM2.5的暴露能够引起ApoE-/-小鼠血清中IL-6、TNF-α水平的升高，说明PM2.5促发了小鼠体内的炎症反应；我们还发现PM2.5组ApoE-/-小鼠动脉硬化斑块发展速度明显快于对照组，PM2.5组小鼠动脉斑块内IL-6、TNF-α、Lp-PLA2、NAD(P)H氧化酶亚基p22phox和p47phox表达显著增加，这说明PM2.5能够通过炎症反应和氧化应激两个方面加速ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的形成。