右美托咪定对老年脓毒症大鼠Shh信号通路及认知功能的影响研究

刘铁军，董晓柳，张树波，赵晓晶，段立昆，李红霞

脓毒症（sepsis）是临床上危重症之一，有研究表明，脓毒症患者可长期伴有不同程度的认知障碍［1］，可能是因患者的血-脑脊液屏障（blood-brain barrier，BBB）结构和功能被破坏。BBB有赖于星形胶质细胞介导的胶质-血管耦合［2］，可通过Shh-Gli经典信号通路诱导脑微血管内皮细胞（BMEC）高表达后紧密连接蛋白，从而促进BBB稳定［3］。近年来，星形胶质细胞分泌的Shh因子在BBB特征中的诱导作用备受关注。Shh信号通路主要由分泌型糖蛋白配体Shh、跨膜蛋白受体Ptc、跨膜蛋白Smo、核转录因子蛋白Gli及下游靶基因组成［4］。右美托咪定是一种高选择性的α2受体激动剂，通过激活蓝斑核α2肾上腺素受体，产生剂量依赖性镇静作用，由于其镇静效果模拟“自然睡眠”［5］，是临床上安全有效的麻醉辅助用药［6］，其也可透过BBB，对脓毒症大鼠具有保护作用［7］，但其对脓毒症所致认知障碍是否有改善的研究报道较少。本研究旨在探讨右美托咪定对老年脓毒症大鼠Shh信号通路及认知功能的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 2019年1—9月，选取健康雄性SD大鼠54只，月龄18～20月，体质量550～600 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，动物实验遵循国际动物伦理学要求。大鼠由专人饲养，环境通风良好、恒温恒湿，可自由进食饮水，严格控制光照周期。采用随机数字表法将所有大鼠随机分为Sham组、CLP组、Dex组，每组18只。

1.2 模型制备

1.2.1 Sham组 Sham组大鼠用2%戊巴比妥钠0.1 ml/100 g腹腔注射麻醉，仰卧固定大鼠，在腹部正中处依次切开皮肤、腹白线，切口约1.5 cm，开腹后分离出盲肠后，用4-0缝线缝合腹壁各层，缝合后以100 ml/kg的0.9%氯化钠溶液皮下注射进行液体复苏。于术后6 h腹腔注射0.9%氯化钠溶液10 μg/kg。

1.2.2 CLP组 CLP组大鼠参照文献［8］采用盲肠结扎穿孔法制备大鼠脓毒症模型，用2%戊巴比妥钠0.1 ml/100 g腹腔注射麻醉大鼠，仰卧固定大鼠，在腹部正中处依次切开皮肤、腹白线，切口约1.5 cm，开腹后分离出盲肠并牵拉出腹腔，在距盲肠尖端约1/2处以2-0尼龙缝线结扎，注意避免结扎回肠及盲肠系膜血管，在结扎处与盲肠末端中点处用18 G无菌注射器针头从系膜缘向对系膜缘做2次贯通穿孔，挤出约0.3 ml肠内容物，后将盲肠连同挤出的肠内容物一同回纳腹腔，用4-0缝线缝合腹壁各层，缝合后以100 ml/kg的0.9%氯化钠溶液皮下注射进行液体复苏。于术后6 h腹腔注射0.9%氯化钠溶液10 μg/kg。

1.2.3 Dex组 Dex组大鼠于脓毒症模型制备后6 h腹腔注射右美托咪定10 μg/kg，模型制备同CLP组。

1.3 行为学检测 采用Morris水迷宫实验［9］评价老年大鼠认知功能，具体如下：模型制备前所有大鼠进行水迷宫适应性训练1 d，造模后进行4 d定位航行实验：每天同一时间将大鼠面朝水池分别从4个象限固定位置放入水中，让其寻找平台位置，找到平台时间即为逃避潜伏期，若120 s内大鼠找到平台，则记录其逃避潜伏时间及运动轨迹，若120 s未找到平台，则引导其找到平台，并停留10 s，加深记忆；第5天进行测试：移除平台，限时120 s，记录逃避潜伏期、穿过平台次数及处于平台所在象限时间。

1.4 脑组织含水量 采用随机数字表法从Sham组、CLP组、Dex组中各选取6只大鼠，剪除大鼠术区鼠毛并消毒，腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉，打开胸腔，经左心室插管至主动脉，在右心耳剪一开口，用500 ml PBS冲洗全身血液循环，当右心耳流出清亮液体后断头，剥离出完整脑组织后迅速取出大鼠脑组织。将大鼠脑组织分成3部分，分别为左侧大脑半球、右侧大脑半球及小脑，将其置于锡纸上做好标记迅速称量各部分脑组织湿重（W），后将脑组织置于恒温干燥箱内，100 ℃干燥24 h，称量各部分脑组织干重（D），计算脑组织含水量=（W-D）/W×100%。

1.5 海马组织Shh、Gli-1及Ptc含量 采用随机数字表法从Sham组、CLP组、Dex组中再各选取6只大鼠，剪除大鼠术区鼠毛并消毒，腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉，打开胸腔，经左心室插管至主动脉，在右心耳剪一开口，用500 ml PBS冲洗全身血液循环，当右心耳流出清亮液体后断头，剥离出完整脑组织后，冰上剥离取出海马组织，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测三组大鼠海马组织Shh、Gli-1及Ptc含量，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.6 海马组织ZO-1、Claudin-5相对表达量 采用Western blot法检测海马组织ZO-1、Claudin-5相对表达量，Sham组、CLP组、Dex组中各剩余6只大鼠，剪除大鼠术区鼠毛并消毒，腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉，打开胸腔，经左心室插管至主动脉，在右心耳剪一开口，用500 ml PBS冲洗全身血液循环，当右心耳流出清亮液体后断头，剥离出完整脑组织后，冰上剥离取出海马组织，加入三去污剂蛋白质裂解缓冲液，4 ℃ 2 000 r/min离心30 min（离心半径10 cm），留取上清液，获得总蛋白，以二喹啉甲酸（BCA）法检测蛋白含量。制备十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）：加样、电泳分离，电转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脱脂奶粉封闭1 h后分别加入一抗：兔抗ZO-1抗体（稀释浓度为1：500，Abcam公司）、兔抗Claudin-5抗体（稀释浓度为1：1 000，Abcam公司），4 ℃孵育过夜。次日复温30 min后，TBST洗膜10 min，重复3次，分别加入相应的二抗（稀释浓度为1：2 000，Abcam公司），放在摇床上轻摇1 h，TBST洗膜10 min，重复3次。暗室内将ECL发光试剂盒（上海乔羽生物科技有限公司）中的A、B液混合成ECL混合液（体积比为1：1），并滴在PVDF膜的蛋白面上，显影成像，应用Quantity One 4.4.0分析软件分析各组相对灰度值，即为目的蛋白的相对表达量。

1.7 统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 逃避潜伏期、穿越平台次数、处于平台所在象限时间 三组大鼠用药后逃避潜伏期、穿越平台次数、处于平台所在象限时间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；与Sham组比较，CLP组、Dex组大鼠用药后逃避潜伏期延长，穿越平台次数减少，处于平台所在象限时间缩短，差异有统计学意义（P＜0.05）；与CLP组比较，Dex组大鼠用药后逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增多，处于平台所在象限时间长，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

表1 三组大鼠用药后逃避潜伏期、穿越平台次数、处于平台所在象限时间比较（±s）Table 1 Comparison of escape incubation period，times of crossing platform and duration of keeping platform quadrant in the three groups after medication

表1 三组大鼠用药后逃避潜伏期、穿越平台次数、处于平台所在象限时间比较（±s）Table 1 Comparison of escape incubation period，times of crossing platform and duration of keeping platform quadrant in the three groups after medication

注：ham组大鼠仅行剖腹探查术，CLP组大鼠采用盲肠结扎穿孔法制备脓毒症模型，Dex组大鼠于脓毒症模型制备后6 h腹腔注射右美托咪定；与Sham组比较，aP＜0.05，与CLP组比较，bP＜0.05

（s）穿越平台次数（次）处于平台所在象限时间（s）Sham 组 18 22.6±1.4 8.9±1.0 65.7±6.8 CLP 组 18 40.8±3.7a 2.4±0.5a 36.2±5.1a Dex组 18 34.1±2.5ab 4.0±0.8ab 48.4±6.3ab F值 69.648 109.247 40.027 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001组别 只数 逃避潜伏期

2.2 脑组织含水量 Sham组大鼠用药后脑组织含水量为（0.73±0.02）%，CLP组大鼠为（0.87±0.04）%，Dex组大鼠为（0.78±0.03）%。三组大鼠用药后脑组织含水量比较，差异有统计学意义（F=31.245，P＜0.001）；与Sham组比较，CLP组、Dex组大鼠用药后脑组织含水量多，差异有统计学意义（P＜0.05）；与CLP组比较，Dex组大鼠用药后脑组织含水量少，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 海马组织Shh、Gli-1、Ptc含量 三组大鼠用药后海马组织Shh、Gli-1、Ptc含量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；与Sham组比较，CLP组、Dex组大鼠用药后海马组织Shh、Gli-1含量降低，Ptc含量升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与CLP组比较，Dex组大鼠用药后海马组织Shh、Gli-1含量升高，Ptc含量降低，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

2.4 海马组织ZO-1、Claudin-5相对表达量 三组大鼠用药后海马组织ZO-1、Claudin-5相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；与Sham组比较，CLP组、Dex组大鼠用药后海马组织ZO-1、Claudin-5相对表达量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与CLP组比较，Dex组大鼠用药后用药后ZO-1、Claudin-5相对表达量升高，差异有统计学意义（P＜0.05，见表3）。

表2 三组大鼠用药后海马组织Shh、Gli-1、Ptc含量比较（ ±s）Table 2 Comparison of contents of Shh，Gli-1 and Ptc in hippocampus in the three groups after medication

表2 三组大鼠用药后海马组织Shh、Gli-1、Ptc含量比较（ ±s）Table 2 Comparison of contents of Shh，Gli-1 and Ptc in hippocampus in the three groups after medication

注：与Sham组比较，aP＜0.05，与CLP组比较，bP＜0.05

组别 只数 Shh Gli-1 Ptc Sham 组 6 0.74±0.03 0.78±0.05 0.45±0.02 CLP 组 6 0.49±0.02a 0.55±0.03a 0.71±0.05a Dex组 6 0.65±0.02ab 0.69±0.04ab 0.52±0.04ab F值 169.762 48.361 72.509 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表3 三组大鼠用药后海马组织ZO-1、Claudin-5相对表达量比较（±s）Table 3 Comparison of relative protein expression quantity of ZO-1 and Claudin-5 in hippocampus in the three groups after medication

表3 三组大鼠用药后海马组织ZO-1、Claudin-5相对表达量比较（±s）Table 3 Comparison of relative protein expression quantity of ZO-1 and Claudin-5 in hippocampus in the three groups after medication

注：与Sham组比较，aP＜0.05，与CLP组比较，bP＜0.05

组别 只数 ZO-1 Claudin-5 Sham 组 6 0.41±0.06 0.29±0.04 CLP 组 6 0.09±0.02a 0.05±0.01a Dex组 6 0.27±0.05ab 0.18±0.02ab F值 71.268 123.716 P值 ＜0.001 ＜0.001

3 讨论

脓毒症是一种严重且致命的疾病，而脑功能的损伤是增加病死率的原因之一，其主要病理特点是脑内皮细胞的紧密连接功能出现障碍，BBB被破坏，进而使全身炎性反应的神经毒性递质进入大脑，造成脓毒症相关性脑病，可表现为学习及记忆能力下降、注意力减弱、生活质量降低等。Claudin-5、ZO-1是BBB中主要的紧密连接蛋白，对维持BBB功能及防止脑水肿至关重要［10］。右美托咪定是临床上效果确切的麻醉辅助用药，可穿过BBB激活中枢神经系统中特异性跨膜α2肾上腺能受体，从而发挥生理效应。目前右美托咪定已被广泛应用于脓毒症患者。

Hedgehog（Hh）基因最先在黑腹果蝇中发现，随后在哺乳动物中发现，Hh家族信号分子包括Shh、Indian hedgehog（Ihh） 和 desert hedgehog（Dhh）［11］， 而 其中作为成形的Shh及其信号通路的研究报道较多。Shh信号通路受体Ptc与配体Shh直接结合，对Hh信号起负调控作用，而Smo是Hh信号传递所必需的受体，对Hh信号起正调控作用。正常情况下，Ptc抑制Smo活性从而阻止下游Gli进入细胞核，进而抑制下游靶基因的转录，而当Ptc和Hh信号结合后会解除对Smo的抑制，促使Gli与某些因子形成复合物进入细胞核内激活下游靶基因转录，从而发挥生物学效应。近年来，许多学者已在多种疾病模型中或临床中进行Shh信号通路研究，发现Shh信号通路不仅参与了胚胎发育［12］、器官形成［13］、肿瘤发生、发展过程［14］，还在神经修复［15］等方面发挥重要作用。有研究表明，在急性缺血性脑卒中动物模型中发现Shh含量上调［16］，脑水肿加重［17］；而在脑室内注射人重组Shh后，BBB通透性降低，脑水肿减轻［18］。故Shh信号通路与维持BBB的完整性密切相关。

本研究结果显示，与Sham组比较，CLP组、Dex组用药后大鼠逃避潜伏期延长，穿越平台次数减少，处于平台所在象限时间缩短；与CLP组比较，Dex组大鼠用药后逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增多，处于平台所在象限时间长；说明脓毒症可导致大鼠出现认知障碍，且右美托咪定可有效改善脓毒症大鼠的认知功能。本研究结果显示，与Sham组比较，CLP组、Dex组大鼠用药后脑组织含水量增多，海马组织ZO-1、Claudin-5相对表达量降低，而与CLP组比较，Dex组大鼠用药后脑组织含水量减少，海马组织ZO-1、Claudin-5相对表达量升高，说明脓毒症可导致大鼠BBB破坏、通透性增加，而右美托咪定可有效降低脓毒症大鼠的BBB通透性。本研究结果显示，与Sham组比较，CLP组、Dex组大鼠用药后海马组织Shh、Gli-1含量降低，Ptc含量升高，而与CLP组比较，Dex组大鼠用药后海马组织Shh、Gli-1含量升高，Ptc含量降低，提示Shh信号通路参与了脓毒症的发病过程，脓毒症可抑制Shh信号通路的激活，而右美托咪定可有效激活Shh信号通路，分析其机制可能为：右美托咪定可透过BBB进入脑内，升高Shh含量，解除对Smo的抑制，使Smo的空间构象发生改变，进一步激活其下游靶基因及Gli-1进入细胞核内从而引发转录，发挥Shh信号介导的通路，从而降低BBB通透性、改善认知功能。

综上所述，右美托咪定可有效改善老年脓毒症大鼠认知功能，降低BBB通透性，其作用机制可能与激活Shh信号通路有关，后续有待开展相关人群研究以进一步验证右美托咪定对老年脓毒症患者认知功能的影响。

作者贡献：刘铁军、董晓柳进行文章的构思与设计；刘铁军、赵晓晶进行研究的实施与可行性分析；段立昆进行数据收集；张树波进行数据整理及文章的质量控制及审校；张树波、李红霞进行统计学处理；董晓柳进行结果的分析与解释；刘铁军负责撰写论文，对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。