景衣安神散穴位贴敷对失眠大鼠神经递质影响的实验研究

胡金霞 卢军 王洪霞 江钰 刘涛 胡晓灵

[摘要] 目的 探討景衣安神散穴位贴敷对失眠大鼠神经递质的影响。 方法 将雄性大鼠64只按随机数字表法分为四组，每组16只，分别为对照组、模型组、空白组、实验组。对照组腹腔注射0.9%氯化钠溶液（1 mL/100 g），1次/d，连续注射2 d，不进行任何干预，连续饲养7 d。模型组、空白组、实验组均采用腹腔注射对苯丙氨酸（PCPA），1次/d，连续注射2 d，制造睡眠剥夺模型。模型组造模后，不进行任何干预，连续饲养7 d。空白组造模后，将空白敷膜贴于神阙、内关穴，1次/d，30 min/次，连续7 d。实验组造模后，将景衣安神散贴敷于神阙、内关穴，1次/d，30 min/次，连续7 d。实验第8天，大鼠断头，开颅取出脑组织，分离出下丘脑，洗净剪碎，匀浆取上清液，采用酶联免疫吸附测定法检测5-羟色胺（5-HT）、5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）、多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NANE）含量。结果 模型组、空白组、实验组大鼠的力竭时间均短于对照组，绝望时间均长于对照组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。空白组、实验组大鼠的力竭时间均长于模型组，绝望时间均短于模型组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。模型组、空白组大鼠下丘脑5-HT含量均低于对照组，实验组大鼠下丘脑5-HT含量高于模型组、空白组，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。模型组、空白组大鼠下丘脑5-HIAA含量均低于对照组，实验组大鼠下丘脑5-HIAA含量高于模型组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。模型组、空白组大鼠下丘脑DA含量均高于对照组，实验组大鼠下丘脑DA含量低于模型组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。模型组、空白组大鼠下丘脑NANE含量均高于对照组，实验组大鼠下丘脑NANE含量低于模型组、空白组，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。 结论 景衣安神散穴位贴敷失眠大鼠可能通过影响下丘脑神经递质水平的变化来改善睡眠。

[关键词] 景衣安神散;穴位贴敷;动物实验;单胺递质

[中图分类号] R-332          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）04（a）-0013-05

Experimental study on the effect of acupoint application of Jingyi Anshen Powder on neurotransmitters in rats with insomnia

HU Jinxia1   LU Jun2   WANG Hongxia1   JIANG Yu1   LIU Tao1   HU Xiaoling1

1.Department of Geriatrics， Xinjiang Uygur Autonomous Region Institute of Traditional Chinese Medicine， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi   830000， China; 2.Department of Pharmacy， Xinjiang Uygur Autonomous Region Institute of Traditional Chinese Medicine， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi   830000， China

[Abstract] Objective To explore the effect of acupoint application of Jingyi Anshen Powder on neurotransmitters in rats with insomnia. Methods According to the random number table method， 64 male rats were divided into four groups： control group （n = 16）， model group （n = 16）， blank group （n = 16） and experimental group （n = 16）. Control group was intraperitoneally injected with 0.9% Sodium Chloride Solution （1 mL/100 g） once a day for 2 days， and fed continuously for 7 days without any intervention. Model group， blank group and experimental group were all injected intraperitoneally with P-phenylalanine （PCPA） once a day for two consecutive days to create a sleep deprivation model. After molding， model group was fed for 7 days without any intervention. After molding， in blank group， blank film was applied to shenque and neiguan acupoints once a day， 30 minutes a time for 7 days. After molding， in experimental group， Jingyi Anshen Powder was applied to shénquē and nèigu？觀n acupoints once a day for 30 minutes for 7 days. On the 8th day of the experiment， the rats were decapitated， the brain tissues were taken out after craniotomy， the hypothalamus was separated， washed and chopped， and the supernatant was taken from the homogenate. Contents of 5-hydroxytryptamine （5-HT）， 5-hydroxyindoleacetic acid （5-HIAA）， dopamine （DA） and noradrenaline （NANE） were measured by enzyme-linked immunosorbent assay. Results The exhaustion time of model group， blank group and experimental group was shorter than that of control group， and the despair time of model group， blank group and experimental group was longer than that of control group， the differences were statistically significant （P < 0.01）. The exhaustion time of blank group and experimental group was longer than that of model group， and the desperation time of blank group and experimental group was shorter than that of model group， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. The contents of 5-HT in model group and blank group were lower than that in control group， the contents of 5-HT in experimental group was higher than that in model group and blank group， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. The contents of 5-HIAA in model group and blank group were lower than that in control group， while the content of 5-HIAA in experimental group was higher than that in model group， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. DA contents of hypothalamus in model group and blank group were higher than that in control group， DA content of hypothalamus in experimental group was lower than that in model group， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. The contents of hypothalamic NANE in model group and blank group were higher than that in control group， the contents of hypothalamic NANE in experimental group were lower than that in model group and blank group， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Jingyi Anshen Powder is applied to the acupoints of insomnia rats to improve sleep by affecting the changes of the level of neurotransmitters in the hypothalamus.

[Key words] Jingyi Anshen Powder; Acupoint application; Animal experiment; Monoamine transmitter

失眠是指经常不能获得正常睡眠为特征的病症。随着社会发展，失眠的发病率呈现上升趋势。在前期临床试验中，我们应用中药结合新疆地产药物组方的“景衣安神散”穴位贴敷治疗失眠，可改善患者夜间的睡眠质量，有效提高患者白天的功能状态，对睡眠有调节作用[1-5]。本研究采用景衣安神散穴位贴敷于对苯丙氨酸（PCPA）致失眠大鼠模型的神阙、内关穴进行治疗，检测其下丘脑单胺类递质5-羟色胺（5-HT）、5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）、多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NANE）的水平，进一步探讨景衣安神散穴位贴敷治疗失眠症的作用机制，为临床提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 样本量的确定

根据前期预实验结果，得出景衣安神散穴位贴敷治疗失眠大鼠的总体有效率，根据多样本比较最小样本量计算公式，计算得出每組样本≥10只。

1.2 实验动物及分组

遵循我国科技部发财字（2006）398号《关于善待实验动物的指导性意见》有关规定对动物进行处置。雄性大鼠64只，由新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心提供，许可证号：SCXK（新）2003-0002，体重（200±20）g，正常饲养。饲养条件为饲养室温度20～25℃，相对湿度50%～65%，光照充分，定时通风换气，饲养期间大鼠自由摄水及饮食。饲养1周后，采用随机数字表法将其分为四组，每组16只，分别为对照组、模型组、空白组、实验组。其中模型组、空白组以及实验组采用腹腔注射PCPA的方法制造睡眠剥夺模型[6]。

1.3 PCPA致失眠大鼠模型的构建

1.3.1 失眠模型的建立方法

将PCPA（艾览化工科技有限公司，货号：A46786）用弱碱性生理盐水配置成混悬液，按45 mg/100 g体重腹腔注射，1次/d，连续注射2 d，造模成功。

1.3.2 造模成功的评判标准

造模后的大鼠，与对照组进行比较，行为发生改变，如昼夜节律颠倒，白天活动明显增多，睡眠时间反而减少，性情烦躁，攻击性增强，如出现这些变化，表明造模成功[7]。

1.4 动物的处理

对照组：腹腔注射0.9%氯化钠溶液（1 mL/100 g），1次/d，连续注射2 d;不进行任何干预，连续饲养7 d。模型组：造模后，不进行任何干预，连续饲养7 d。空白组：造模后，每天将空白敷膜贴敷于神阙、内关穴[8-10]。贴敷方法：固定大鼠后，将穴位附近的毛剪短，脱净，约1 cm2大小，常酒精消毒，空白敷膜贴敷于穴位上，1次/d，30 min/次，连续7 d。实验组：造模后，将景衣安神散贴敷于神阙、内关穴，贴敷方法同空白组，1次/d，30 min/次，连续7 d。

1.5 观察指标

1.5.1 大鼠一般行为观察

于造模后以及治疗后每天观察大鼠昼伏夜出的节律，白天活动以及睡眠情况，精神状态、性情变化，并记录变化。

1.5.2 强迫游泳实验与悬尾实验

于实验第7天对各组大鼠均进行实验学检测[强迫游泳实验（FST）[11]、悬尾实验（TST）[12]]。记录大鼠的不动时间（IM）。

1.5.2.1 FST  大鼠被放置在一个单独的垂直玻璃管（高50 cm，直径20 cm，其中水的高度30 cm，水温25℃）中，并开始计时。当大鼠头部沉入水中内，不能浮出水面时，将其捞出，并记录力竭时间。

1.5.2.2 TST  大鼠被悬挂在距离桌面50 cm高的水平环状架杆，用胶带固定鼠尖2 cm，记录大鼠6 min内的不动时间，即绝望时间。

1.5.3 单胺递质的检测

实验第8天，大鼠断头，开颅取出脑组织，分离出下丘脑，在冷生理盐水中洗去血液，称重后，置于 -85℃低温冰箱保存备用。

1.5.3.1 组织匀浆  从冰箱中取出已经冲洗并称重的脑组织进行剪碎，与对应体积的PBS（一般按1∶9的重量体积比，PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。后匀浆液进行超声破碎或反复冻触。最后将匀浆液以5000×g离心5～10 min，取上清检测。

1.5.3.2 检测方法  用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测下丘脑5-HT、5-HIAA、DA、NANE的含量[9]（5-HT试剂盒E-EL-0033C96T、5-HIAA试剂盒E-EL-0075C96T、DA试剂盒E-EL-0046C96T、NANE试剂盒E-EL-00475C96T，均由武汉伊莱瑞特生物科技有限公司生产）。

1.6 统计学方法

采用SPSS 23.0统计软件进行统计学处理。符合正态分布的计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐性采用Levene法检验，两两比较采用LSD法，方差不齐时用Tamhane′s法检验，多个样本均数间两两比较采用Bonferroni法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 失眠大鼠行为学变化

模型组大鼠于腹腔注射PCPA后第1天，与空白组比较，昼伏夜出节律紊乱，白天活动频繁，睡眠明显减少，兴奋性增高，好动易怒，有攻击性，情绪极其不稳定;第3、4天后，大鼠变得萎靡不振，兴奋性降低，容易受外界影响而惊醒活动。空白组、实验组在接受治疗后第1天，与模型组比较，大鼠攻击性逐渐减弱，相对安静;在治疗后的第2～4天，实验组大鼠攻击性进一步减弱，困倦乏力，喜欢睡卧，活动减少，出现睡意，不容易被外界惊醒;在治疗后的第5～7天，基本趋于正常，昼伏夜出，节律恢复正常，白天睡觉，夜晚活动，睡眠-觉醒周期与对照组趋于相同。

2.2 各组大鼠力竭时间和绝望时间比较

模型组、空白组、实验组大鼠的力竭时间均短于对照组，绝望时间均长于对照组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。空白组、实验组大鼠的力竭时间均长于模型组，绝望时间均短于模型组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表1。

表1   各组大鼠力竭时间和绝望时间比较（ms，x±s）

注：与对照组比较，*P < 0.01;与模型组比较，#P < 0.01

2.3 各组大鼠下丘脑5-HT和5-HIAA含量比较

模型组、空白组大鼠下丘脑5-HT含量均低于对照组，实验组大鼠下丘脑5-HT含量高于模型组、空白组，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。模型组、空白组大鼠下丘脑5-HIAA含量均低于对照组，实验组大鼠下丘脑5-HIAA含量高于模型组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表2。

表2   各组大鼠下丘脑5-HT和5-HIAA含量比较（ng/mL，x±s）

注：与对照組比较，*P < 0.01;与模型组比较，#P < 0.01;与空白组比较，△P < 0.05。5-HT：5-羟色胺;5-HIAA：5-羟吲哚乙酸

2.4 各组大鼠下丘脑DA含量比较

模型组、空白组大鼠下丘脑DA含量均高于对照组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。实验组大鼠下丘脑DA含量低于模型组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表3。

2.5 各组大鼠下丘脑NANE含量比较

模型组、空白组大鼠下丘脑NANE含量均高于对照组，实验组大鼠下丘脑NANE含量低于模型组、空白组，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见表4。

表4   各组大鼠下丘脑NANE含量比较（ng/mL，x±s）

注：与对照组比较，*P < 0.01;与模型组比较，#P < 0.01;与空白组比较，△P < 0.05。NANE：去甲肾上腺素

3 讨论

失眠中医称之为“不寐”“不得眠”，为临床常见病。失眠是由于“卫气不得入于阴，常留于阳。留于阳则阳气满，阳气满则阳跷盛，不得入于阴则阴气虚，故目不暝矣”。《素问·至真要论》曰：“谨察阴阳所在而调之，以平为期。”治疗失眠的关键在于调节阴阳的偏盛偏衰，疏通经络，促使机体归于“阴平阳秘”，恢复正常的生理功能。

本实验采用景衣安神散，该方是胡晓灵主任医师根据失眠的病因病机，结合新疆地域特色，选择新疆地产药物及中药组方治疗本病。其方主要由红景天、薰衣草、石菖蒲等组成。其中蔷薇红景天补肺脾肾精元之气，以养血、扶正固本。现代药理研究表明，红景天可以增强脑功能，消除疲劳，镇定安神[13];薰衣草有行气活血、提神醒脑、疏解焦虑、改善失眠的功效[14];石菖蒲解郁化浊。以上各药共奏益气活血、化痰解郁、养心安神之效。取穴神阙、内关。神阙为生命的关口、人体经脉之根本、经络之总枢、经气之汇海，通过任、督、冲、带四脉而统属全身经络，联系五脏六腑。在正常情况下，任、督、冲、带脉经气相通，阴阳相济，调节各脏腑、经络的正常生理活动。根据“内病外治”理论，贴敷神阙穴，通过刺激神阙穴调整任、督、冲、带的功能，以调和诸脏腑气血阴阳，达到阴平阳秘的治疗目的。内关乃手厥阴心包经络穴，别走手少阳三焦经，是八脉交会穴中阴维脉的会穴，主治本经经病和胃、心、心包络疾患，以及与情志失和、气机阻滞有关的脏腑器官、肢体病变，有养心安神之功，维系诸阴之经。刺激内关，可以调摄阴阳，调和气血，维持内环境，达到阴平阳秘的目的。景衣安神散通过内关、神阙穴位贴敷疗法，可以刺激穴位，依靠经络循行的传输发挥药物作用;同时穴位局部的药物通过微小血管的吸收到达体内产生作用。这个吸收过程不刺激胃肠道，不经过肝肾代谢，可以明显降低药物在体内的毒副作用。由于药物在穴位局部浓度相对最高，可以维持稳定持久的血药浓度，减少给药次数[15]。我们在前期临床研究中观察到，景衣安神散通过刺激双侧涌泉以及神阙穴位，达到内病外治的作用，调整阴阳，引阳入阴，使昼夜阴阳运转恢复正常，对改善睡眠有明显作用[1-5]。

失眠的发病机制尚不明确，有研究认为，失眠与机体神经-免疫、中枢神经递质、抗氧化等系统调控密切相关[16]。有研究认为，脑桥背内侧被盖的蓝斑头部、视交叉上核和丘脑、脑干的中缝核等特定结构以及中枢神经系统内神经递质的作用与失眠关系密切[17]。存在脑内蓝斑头部和桥脑的NA神经元，与快波睡眠有关，是快波睡眠的“执行机制”，在维持觉醒中起着重要作用[18]。中脑的DA神经元有维持觉醒和行为兴奋的作用。5-HT是引发非快速动眼睡眠的重要神经递质，被认为是脑内的“致眠因子”。5-HT可部分介导中缝背核对睡眠-觉醒进行调节作用。5-HT合成的限速酶是色氨酸氢化酶（TDH），而PCPA为TDH的抑制剂，故PCPA可以耗竭中枢神经内的5-HT[19-20]。5-HIAA作为5-TH生成的无活性酸性代谢产物而存在，其可反映5-TH的水平[21]。有研究发现，通过升高脑内5-HT、5-HIAA含量，降低DA、NE含量，可以明显改善睡眠[22]。

本研究对大鼠腹腔注射PCPA后，正常的睡眠-觉醒周期遭到破坏，绝望时间缩短，力竭时间延长，出现昼夜节律紊乱，白天活动明显增多，失眠，焦虑，烦躁不安，易惊吓，夜晚萎靡不振，嗜睡少动。本研究发现，模型组大鼠下丘脑5-HT以及其代谢产物5-HIAA含量均降低，DA及NANE含量升高，与对照组比较，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。上述结果提示失眠与神经递质的水平变化有关。5-HT及其代谢产物5-HIAA可帮助睡眠，DA及NANE含量升高，可引起觉醒，导致失眠。经穴位贴敷治疗后发现，失眠大鼠的行为发生改变，绝望时间延长，力竭时间缩短，大鼠的攻击性逐渐减弱，困倦乏力，喜欢睡卧，白天活动减少，夜晚活动增多，昼伏夜出节律恢复正常，睡眠-觉醒周期趋于恢复正常。与模型组比较，实验组可降低失眠大鼠下丘脑中的5-HT，升高其代谢产物5-HIAA，同时升高下丘脑中的DA，降低NANE含量，与模型组比较，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。通过调节下丘脑神经递质水平变化，达到阴平阳秘、恢复睡眠的目的。

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（收稿日期：2019-10-09  本文编辑：李亚聪）