过表达miR-34a对肾癌细胞株769-P生物学行为的影响

吕 川 王 超

(济宁医学院附属济宁市第一人民医院,济宁 272011)

肾癌是泌尿系统最常见的肿瘤之一，大约占人类恶性肿瘤的3%。近年来，肾癌患病率逐年增高，且人群呈年轻化趋势。由于肾癌对放化疗皆不敏感，外科手术已成为治疗肾癌的主要手段，但对于转移性和高危肾癌患者的治疗效果仍不理想。肾癌中透明细胞癌作为最常见的类型，大约占肾癌的80%。目前，关于肾透明细胞癌的侵袭和转移的治疗依然面临许多困难。因此，透明细胞癌的靶向治疗可能为提高肾癌预后带来新的希望。

miR-34a是受肿瘤抑制基因p53调控的具有肿瘤抑制作用的miRNA，对肿瘤细胞周期阻滞、凋亡、细胞生长抑制以及肿瘤干细胞抑制等发挥重要作用[1-2]。本研究通过病毒感染肾透明细胞癌细胞769-P， 过表达其miR-34a水平，探讨miR-34a对769-P细胞增殖、迁移能力及细胞周期等生物学行为的影响，为研究肾透明细胞癌靶向治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人肾癌细胞株769-P、786-O、ACHN、OSRC来源于西安交通大学泌尿外科研究所，慢病毒载体miR-NC和miR-34a由上海吉玛制药技术有限公司合成，RMPI1640培养基购自Gbico公司，胎牛血清购自Hyclone公司，PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit、SYBR Premix Ex TaqII购自TaKaRa公司，Trizol试剂及miR-34a实时定量PCR引物购自北京天根生化科技有限公司，细胞周期检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所，Transwell小室(孔径8μm)购自MILLIPORE公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养及分组 人肾癌细胞株769-P、786-O、ACHN、OSRC用含10%胎牛血清的RMPI1640培养基，在37℃、5%CO2恒温孵育箱中培养，细胞对数生长期传代。将对照载体与miR-34a表达慢病毒载体感染769-P，建立稳定表达空载体(NC)与miR-34a的细胞株，实验分为空白对照组、NC组、miR-34a组。

1.2.2转染实验 取对数生长期769-P细胞传代，接种于6孔培养板，每孔接种2～3×105个/ml 769-P细胞，待细胞密度约70%时，取慢病毒滴度液NC和miR-34a 10μl和20μl感染细胞，并加入polybrene增加感染效率。24h后弃去慢病毒培养液换成正常培养液。倒置荧光显微镜观察绿色荧光检测感染效率。

1.2.3qRT-PCR 提取细胞总RNA。反转录成cDNA，反应体系20μl。PCR反应以U6RNA为内参，其引物为U6-forward 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’和U6-reverse 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’,miR-34a实时定量PCR引物序列为miR-34a-forward 5’-TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT-3’和miR-34a-reverse 5’-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3’。实时荧光定量PCR仪进行PCR扩增及分析，设置3个复孔，独立重复实验3次。

1.2.4细胞增殖实验 将空白对照组、NC组及miR-34a组对数期生长细胞用胰酶消化，培养基稀释成5×105个/ml，取4块96孔板，分别标记0、24、48、72h，每组细胞设置6个复孔。Gen5酶标仪检测490nm下吸光度值，并依据结果制作生长曲线，抑制率(IR)计算:(1-miR-34a组/空白对照组)×100%，独立重复实验3次。

1.2.5Transwell迁移实验 取空白对照组、NC组及miR-34a组对数生长期细胞200μl/组接种于Transwell(8μm)上室，下室加入800μl 10%胎牛血清RMPI1640培养基，每组细胞设置3个复室，置于37℃培养箱孵育24h，固定染色，显微镜下随机取5个视野计数并拍照。

1.2.6细胞周期实验 将空白对照组、NC组及miR-34a组对数期生长细胞用加入预冷的70%乙醇，置于4℃固定过夜，离心并PBS洗涤后加入含50μg/ml溴化乙锭(PI)、100μg/ml RNase A、 0.2% Triton X-100的500μl PBS， 4℃避光环境下孵育30min，流式细胞仪检测各组细胞周期。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 miR-34a在各肾癌细胞株中相对表达水平

选取4种人肾癌细胞株769-P、786-O、ACHN、OSRC进行实验，其中769-P细胞miR-34a表达量在4种肾癌细胞株中最低(图1)，因此，选取肾透明细胞癌细胞株769-P作为研究对象，观察过表达miR-34a后769-P细胞生物学行为的改变。

图1 miR-34a在各肾癌细胞系中的表达

2.2 过表达miR-34a对769-P细胞增殖的影响

过表达miR-34a后，miR-34a组细胞增殖能力降低，在48h、72h增殖明显受到抑制(P<0.025)。见图2。

注：与空白对照组、NC组比较，*P<0.025

图2 miR-34a对769-P细胞增殖的影响

2.3 过表达miR-34a对769-P细胞迁移能力的影响

miR-34a组与空白对照组及NC组细胞相比，穿膜细胞数目明显减少(P<0.025)。3组迁出细胞数分别为：(382.18±37.84)、(398.57±24.09)和(103.73±17.36)个。见图3。

注:Aa.空白对照组，Ab.NC组，Ac.miR-34a组
与空白对照、NC两组比较，*P<0.025

图3 过表达miR-34a对769-P细胞迁移能力的影响

2.4 过表达miR-34a对769-P细胞周期的影响

空白对照组、NC组和miR-34a组S期细胞比例分别为(37.31±2.12)%,(35.96±1.78)%，(57.24±2.67)%，miR-34a组S期细胞比例比另两组显著升高(P<0.025)，表明miR-34a可将769-P细胞周期阻滞于S期。见图4。

注：与空白对照组、NC组比较，*P<0.025

图4 miR-34a对细胞周期的影响

3 讨论

目前，关于透明细胞癌的侵袭和转移的治疗依然面临许多困难，也是肾癌致死的主要原因之一。治疗肾癌的主要方法是手术治疗，但针对肾癌的辅助治疗和靶向治疗也日益受到推崇，这可能是未来研究的主要方向[3]。

miR-34a作为肿瘤抑制物在人类多种肿瘤组织和细胞中低表达[4-5]。与正常邻近肾脏组织相比，80%肾癌组织中miR-34a显著下调[6]。肿瘤细胞的增殖在很大程度上破坏了正常细胞组织，从而促进肿瘤的进展。目前miR-34a在肿瘤中失调的机制仍未明确。很多证据表明CpG甲基化导致的转录沉默在肿瘤抑制基因失活过程中发挥作用，同时可能促进细胞具有选择优势的克隆生长[7]。本文结果显示过表达miR-34a显著抑制769-P细胞的增殖，提示miR-34a有可能成为肾透明细胞癌治疗的新靶点。

肿瘤细胞的恶性程度与其本身迁移能力的强弱有一定的关系，细胞的迁移能力受多种细胞信号通路的介导，miR-34a可通过靶向调节多种致癌基因，如c-Met、Bcl-2、E2F3、Notch1等介导调节细胞的侵袭和迁移，从而发挥抑癌作用[8]。本文结果显示miR-34a对肾癌细胞株769-P细胞的迁移有明显抑制作用，由此推测，miR-34a可通过靶向多种癌基因参与了抑制769-P细胞迁移的作用。

细胞周期的调控也是恶性肿瘤的生物学特征之一，细胞周期依赖激酶和细胞周期蛋白在G1/S期、G2/M期及S期起到了关键作用[9]，本实验通过miR-34a过表达建立稳定感染的细胞株，发现miR-34a组S期的细胞比例显著高于空白 对照组，表明miR-34a可通过诱导细胞周期停止在S期，发挥抑制细胞增殖的作用。

综上所述，miR-34a转染肾癌769-P细胞可抑制其增殖、迁移，可为肾癌的基因治疗提供新的思路。