自噬对卡培他滨结肠癌体外化疗效果的影响及机制探讨*

陈志航，顾智文，高枫，张森，张小龙

广西医科大学第一附属医院结直肠肛门外科 广西南宁 530021

结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，其发病率较高，目前主要以手术治疗为主，对于中晚期患者，除了手术治疗同时也需要化疗来改善疗效。卡培他滨是目前首选的一线化疗药物之一[1]，具有较好的单药治疗效果和联合化疗效果，但是其疗效依然有限，对部分患者效果不佳，会产生耐药性。进一步探究如何提高卡培他滨的化疗效果，探索以卡培他滨为基础的新型化疗方案具有重要的临床价值。细胞自噬是真核生物细胞内物质进行周转的重要过程，通过自噬，一些损坏的蛋白或细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后，进入溶酶体中进行降解并得以循环利用[2]。有研究表明：细胞自噬的激活会对细胞产生保护效果，阻止其发生凋亡，自噬可以帮助肿瘤细胞耐受或阻止化疗药物毒性所引起的细胞破坏，而抑制细胞的自噬将削弱这一保护效应[3]。因此探索细胞自噬与肿瘤之间的关系有助于探索更有效的肿瘤治疗方法。本研究目的是在体外实验中探究在细胞自噬抑制或激活后，卡培他滨对结肠癌细胞HCT-116 增殖与凋亡的影响，从而为寻找更加有效的以卡培他滨为基础的化疗方案提供新的思考方向，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

DMEM 高糖培养基与澳洲胎牛血清购自美国Gibco 公司；胰酶、二甲基亚砜、双抗-青链霉素混合液均购自北京索莱宝公司；卡培他滨（capecitabine，CAP）、3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）与雷帕霉素（rapamycin，RAPA）均购自美国MedChemExpress公司；CCK8试剂购自日本同仁化学研究所；MTT试剂盒、Western-bolt 实验相关材料购自中国碧云天公司；AnnexinV-FITC/PI 细胞凋亡双染试剂盒购自美国BD 公司；Beclin-1、LC3 兔抗人单克隆抗体均购自美国CST公司；Bcl2与Bax兔抗人单克隆抗体购自美国Abcam 公司；山羊抗兔IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 680 购自赛默飞世尔科技公司；mCherry-GFP-LC3 双标腺病毒购自上海吉凯基因公司。细胞培养箱购自北京泰泽瑞达科技有限公司；流式细胞仪购自美国BD公司；酶标仪购自美国伯腾公司；双色红外成像系统购自美国LI-COR 公司；激光共聚焦显微镜购自日本Nikon 公司；蛋白电泳及转膜仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人结肠癌细胞株HCT-116 购自上海中国科学院细胞库。HCT-116 细胞常规培养于含有100 mL/L 胎牛血清并添加100 IU/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素的DMEM 高糖培养基中，并置于37 ℃的CO2培养箱中贴壁培养，2 d更换1次培养液。

1.2.2 CCK8法检测细胞增殖 实验分为无细胞不加药仅含培养基的空白对照组（A空白组）、含细胞和培养基不加药的对照组（A对照组）和加药（CAP浓度分别0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L、3 mmol/L、4 mmol/L、5 mmol/L）的实验组（A加药组）。取对数生长期的HCT-116 细胞接种于96 孔板中，约1×105个细胞/孔。细胞培养24 h 后加入不同浓度的CAP，每组设3个重复孔。继续培养12 h、24 h、48 h、72 h后加入CCK8溶液，每孔10 μL。继续培养4 h后用酶标仪测定450 nm 处的吸光度，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=（A 对照-A 加药）/（A 对照-A空白）×100%。

1.2.3 Western-blot 检测细胞蛋白浓度变化 将对数生长期的HCT-116 细胞70%～80%的密度接种于6孔板上，按不加药空白对照组与加药（CAP、CAP+3-MA、CAP+RAPA）组处理，继续培养48 h。去掉培养基后加入RIPA 裂解液冰上裂解30 min，收集液体后13 000 rpm 4 ℃离心30 min。蛋白用8%～15%SDS-PAGE 凝胶电泳分离，半干法转印至PVDF 膜上，转膜结束后5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗（1:1 000）4 ℃摇床过夜，加入荧光二抗（1:5 000）室温孵育1 h后使用双色红外激光成像系统扫描检测蛋白（分别为Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Bax、Bcl2以及内参GAPDH）变化情况。

1.2.4 MTT 法检测细胞活力 实验分为无细胞不加药仅含培养基的空白对照组（B 空白组）、含细胞和培养基不加药的对照组（B 对照组） 和加药（CAP、CAP+3-MA、CAP+RAPA）的实验组（B 加药组）。取对数生长期的HCT-116 细胞接种于96 孔板中。细胞培养24 h 后加药,每组3 个重复孔。继续培养12 h、24 h、48 h、72 h 后每孔加入20 μL MTT溶液，继续培养4 h。吸去培养液，每孔加入150 μL DMSO，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。用酶标仪测定450 nm 处的吸光度，计算细胞活力。细胞活力=（B 加药-B 空白）/（B 对照-B 空白）×100%。

1.2.5 流式细胞仪检测凋亡细胞 实验分为不加药的空白对照组和加药（CAP、CAP+3-MA、CAP+RAPA）的实验组。取对数生长期的HCT-116细胞接种于6孔板中，培养24 h后加药，继续培养48 h。按照AnnexinV-FITC/PI 细胞凋亡双染试剂盒说明书提供的方法进行操作，PBS 洗涤重悬并离心细胞2 次，加入100 μL 1×Binding Buffer重悬细胞后，加入5 μL AnnexinV-FITC轻轻混匀，闭光孵育15 min后加入PI染料继续孵育5 min，最后补加400 μL 1×Binding Buffer后使用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。

1.2.6 mCherry-GFP-LC3自噬双标腺病毒转染 取对数生长期的HCT-116 细胞接种于24 孔板中。mCherry-GFP-LC3 质粒使用制造商推荐的Lipofectamine 2000（Invitrogen，USA）转染至HCT-116细胞中，继续培养24 h 等待细胞贴壁。转染成功后进行药物实验，实验分为对照组（不使用药物）与加药组（分别加入CAP、CAP+3-MA、CAP+RAPA）。之后继续培养48 h后使用激光共聚焦显微镜拍摄并分析对照组与加药组的自噬流变化情况。

1.3 统计学分析

选用SPSS 22.0 统计学软件对数据进行处理，采用GraphPad Prism 6.01作图。计量资料以（xˉ±s）表示，两组组间比较行t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义，所有实验重复3次，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

2 结果

2.1 卡培他滨对结肠癌细胞HCT-116细胞增殖的影响

CCK8检测结果显示，HCT-116细胞在不同浓度（0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4 mmol/L、5 mmol/L）的CAP 分别作用12 h、24 h、48 h、72 h后，细胞生长受到明显抑制，且CAP 对结肠癌细胞HCT-116 的生长抑制作用具有浓度依赖关系，并且与作用时间相关，随着药物浓度的升高，细胞增殖抑制率明显升高，在4 mmol/L 时达到最大效果。而药物作用时间在48 h 时达到最大抑制效果（见图1）。由于CAP 浓度过低会导致凋亡效果不明显，而浓度过高会导致细胞凋亡过多，无法反应抑制或激活细胞自噬后凋亡的变化情况，经计算CAP 在结肠癌细胞中的IC50约在2.142 mmol/L，因此使用2 mmol/L的CAP作为后续实验条件。

图1 CCK8检测CAP对结肠癌细胞HCT-116的细胞增抑制率

2.2 3-MA、RAPA对HCT-116细胞自噬的作用

使用不同浓度（0 mmol/L、2 mmol/L、4 mmol/L、6 mmol/L）的3-MA处理结肠癌细胞HCT-116，48 h后提取细胞中的蛋白，采用Western-blot法检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ与Beclin-1的表达。实验发现使用3-MA处理HCT-116细胞后LC3与Beclin-1蛋白的表达降低，且随着药物浓度的升高，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ与Beclin-1蛋白的表达降低更加明显（见图2）。使用不同浓度（0 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、150 nmol/L）的RAPA处理HCT-116细胞48 h。Western-blot结果提示RAPA可引起肠癌细胞HCT-116中LC3与Beclin-1蛋白表达升高，且随着药物浓度升高蛋白表达量升高（见图3）。根据实验结果可看出3-MA可抑制HCT-116细胞自噬的发生，RAPA可激活HCT-116细胞的自噬，经计算3-MA在结肠癌细胞中的IC50约为3.798 mmol/L，而RAPA在结肠癌细胞中的IC50约为94.633 nmol/L，根据结果后续实验将使用4 mmol/L的3-MA与100 nmol/L的RAPA进行实验。

图2 3-MA对HCT-116细胞自噬的作用

图3 RAPA对HCT-116细胞自噬的作用

2.3 不同用药组的HCT-116细胞中凋亡蛋白Bcl2与Bax的表达

Western-blot 蛋白检测结果显示，单独使用CAP时，Bcl2/Bax蛋白表达较对照组下降，表明此时细胞凋亡增加；CAP+3-MA 组的Bcl2/Bax 蛋白表达较CAP 组的Bcl2/Bax 蛋白表达出现了明显下降，说明此时细胞的凋亡相较于CAP 组增多；CAP+RAPA 组的Bcl2/Bax 蛋白表达较CAP 组升高，说明细胞凋亡相较于CAP组减少（见图4）。

图4 不同用药组的HCT-116细胞中凋亡蛋白Bcl2与Bax的表达

2.4 3-MA及RAPA对卡培他滨引起的细胞自噬作用的影响

将mCherry-GFP-LC3 自噬双标腺病毒转染至HCT-116 细胞，使HCT-116 细胞中可观察到不同的荧光信号。在非自噬情况下mCherry-GFP-LC3 以弥散的黄色荧光形式存在，而在发生自噬的情况下mCherry-GFP-LC3 以聚集的黄色斑点的形式存在。使用不同药物处理转染后的HCT-116 细胞48 h 后，使用激光共聚焦显微镜观察细胞。可以观察到，不使用任何药物时黄色荧光处于弥散状态，细胞自噬并不活跃；单独使用CAP 时黄色荧光部分聚集，说明细胞自噬被CAP 激活；3-MA+CAP 组黄色荧光聚集减少，表明3-MA 可抑制CAP 引起的细胞自噬；而RAPA 与CAP 共同作用于HCT-116 细胞时黄色荧光大量聚集，自噬体比单独使用CAP 时增多，表明RAPA 可促进CAP 引起的细胞自噬（见图5）。使用Western-blot 法检测自噬相关蛋白LC3 与Beclin-1 在不同药物处理的HCT-116 细胞中的表达。可以看出与不使用药物的对照组相比，单独使用CAP 时LC3蛋白与Beclin-1蛋白的表达增加，而3-MA与CAP共同作用于HCT-116 细胞时LC3 蛋白与Beclin-1 蛋白的表达明显降低，当同时使用RAPA与CAP时LC3蛋白与Beclin-1 蛋白的表达相对与单独使用CAP 时增多（见图6）。

图5 mCherry-GFP-LC3双标腺病毒检测不同用药组HCT-116细胞的自噬流变化

图6 不同用药组HCT-116细胞中自噬相关蛋白LC3与Beclin-1表达量的变化

2.5 抑制和激活细胞自噬对卡培他滨引起的结肠癌细胞凋亡的作用

MTT 结果显示，HCT-116 细胞在经CAP 处理后细胞活力明显下降；经CAP 与3-MA 联合作用的HCT-116 细胞的细胞活力相较于CAP 组的HCT-116细胞的细胞活力出现了下降；使用CAP与RAPA同时处理的HCT-116细胞的细胞活力高于CAP组的HCT-116 细胞。而药物处理的时间对细胞活力也存在影响，药物分别作用12 h、24 h、48 h、72 h 后发现，随着作用时间上升，细胞活力出现了下降，在48 h时细胞活力达到最低，而在72 h 时细胞活力出现了回升，因此药物最佳作用时间应为48 h（见图7）。同时流式细胞凋亡检测法结果显示药物作用48 h时，不使用任何药物的HCT-116细胞的细胞存活率为94.0%，在单独使用CAP时细胞存活率下降到50.3%，CAP联合3-MA 使用时存活率降低到26.6%，而CAP 联合 RAPA组细胞存活率达到86.6%（见图8）。

图7 MTT检测不同用药组HCT-116细胞在药物处理后的HCT-116细胞存活率

图8 流式细胞凋亡法检测不同药物处理后48 h的HCT-116细胞细胞凋亡情况

3 讨论

细胞自噬是将细胞内受损、变性或衰老的蛋白质以及细胞器运输到溶酶体进行消化降解的过程。研究表明细胞自噬与肿瘤的发生发展有着密切关系，在正常细胞中，细胞自噬利于细胞保持稳定的平衡状态，而当细胞处于应激状态时，细胞自噬可防止有毒物质对细胞造成损伤，同时细胞自噬可抑制细胞癌变[4]。然而，在肿瘤细胞早期状态中，自噬能够对肿瘤细胞造成损伤从而抑制肿瘤细胞的生长与增殖，当肿瘤细胞进入进展期后，自噬又可抑制药物对细胞的细胞毒性作用，阻止药物对肿瘤细胞产生损伤[5]。在肿瘤化疗中，自噬可以通过隔离并分解被化疗药物破坏的蛋白与细胞器，从而起到保护肿瘤细胞的作用，降低化疗药物的治疗效果。

结肠癌作为一种高发病率的恶性肿瘤，严重威胁着人类的健康，而化疗能够有效地减少肿瘤的复发并延长患者生命。然而化疗药物的耐药性问题严重影响了结肠癌的治疗效果，新化疗方案的研究变得更加迫切。既往研究表明LC3与Beclin-1蛋白的表达与自噬的发生密切相关，当自噬激活时细胞中的LC3与Beclin-1蛋白表达将升高[6]，根据本实验结果可看出3-MA可抑制HCT-116细胞的自噬，RAPA可激活HCT-116细胞的自噬。而Bax和Bcl2是与凋亡相关的蛋白，Bax蛋白表达的升高与Bcl2蛋白的降低意味着细胞凋亡增加[7]，根据本实验结果可初步判断3-MA增强了卡培他滨促进HCT-116细胞凋亡的能力，而雷帕霉素降低了卡培他滨促进HCT-116细胞凋亡的能力。随后使用MTT及流式细胞凋亡检测确定3-MA增强了卡培他滨促进HCT-116细胞凋亡的能力，而雷帕霉素降低了卡培他滨促进HCT-116细胞凋亡的能力。本研究通过体外实验发现：卡培他滨可抑制结肠癌细胞的生长并促进其凋亡的发生，同时卡培他滨引起了细胞自噬反应的激活；通过自噬抑制剂3-MA抑制自噬反应，细胞凋亡明显增加，提高了卡培他滨的化疗效果；而自噬激活剂雷帕霉素进一步激活了细胞自噬反应的发生，抑制了卡培他滨引起的细胞凋亡。这为新化疗方案的研究提供了重要思路。

雷帕霉素作为mTOR抑制剂，可通过抑制mTORRaptor蛋白的表达，引起细胞的凋亡，抑制细胞生长，但同时雷帕霉素也是一种细胞自噬激活剂，小剂量的雷帕霉素对细胞凋亡影响并不明显，可作为细胞自噬激活剂使用[8]。有研究表明，在体外试验中一定剂量的雷帕霉素对结肠癌细胞具有较好的杀伤效果，但在临床实验中雷帕霉素的表现并不理想，其对结肠肿瘤的杀伤效果与体外研究中的结果有很大差距，并未观察到治疗结肠癌的确切效用[9]，这可能与雷帕霉素具有细胞自噬激活效果相关，而其具体机制还有待研究。而在本研究中发现小剂量雷帕霉素作为自噬激活剂明显抑制了卡培他滨的细胞毒性，降低了卡培他滨的化疗效果。3-MA作为一种常见的选择性PI3K抑制剂，可以有效地抑制PI3K通路的激活，同时3-MA也是一种有效的自噬抑制剂，有许多研究表明3-MA能够有效地联合其他化疗药物促进肿瘤细胞凋亡[10]。本研究发现卡培他滨作用于结肠癌细胞后细胞自噬被激活，而与3-MA共同作用后，细胞自噬被抑制，而细胞凋亡出现了增加。基于本研究认为，自噬的激活与抑制可影响卡培他滨的化疗效果，使用自噬抑制剂联合卡培他滨可更有效杀伤体外结肠癌细胞，更进一步的机制及化疗干预决策探索将在今后的研究中继续进行。