热处理对过氧自由基氧化米糠蛋白体外胰蛋白酶消化性质及消化产物抗氧化性的影响

李 芳 黄慧敏 尤翔宇 吴 伟 吴晓娟

(中南林业科技大学食品科学与工程学院;稻谷及副产物深加工国家工程实验室,长沙 410004)

米糠是稻米加工的副产品之一，产量大、营养丰富且极具开发价值[1]。米糠中含有活性极强的脂肪水解酶，能诱导脂肪水解，导致米糠水解酸败；水解产生的游离脂肪酸在内源脂肪氧合酶的作用下发生脂质过氧化反应，形成的脂质过氧化产物会进一步诱导米糠蛋白氧化，导致米糠氧化酸败[2]。蛋白质氧化通常会诱导蛋白质产生共价交联聚集体，此类聚集体的形成对蛋白质的功能性质和消化性质影响颇大[3]。过氧自由基是脂质过氧化产物中一种极具代表性的自由基[4]，尤翔宇等[5]研究发现过氧自由基能促使米糠蛋白氧化并产生结构变化，进而影响米糠蛋白体外胃蛋白酶的消化性质[6]。热处理在食品工业中是一种非常重要的加工方式，加热会导致蛋白质结构改变，导致其消化性质发生显著变化，通常热处理能提高蛋白质的体外消化率[7]。在米糠蛋白的加工过程中，氧化和热处理是同时存在的，然而氧化和热处理会对米糠蛋白消化性质产生不同的影响，因此，只有了解二者共同作用对米糠蛋白消化性质产生影响的机理，才能更好地实现米糠蛋白规模化综合应用。基于此，本研究以米糠蛋白为实验原料，选用AAPH有氧热降解产生的过氧自由基代表米糠酸败过程中产生的脂质自由基对米糠蛋白进行不同程度的氧化，结合加热处理氧化米糠蛋白，在胃蛋白酶酶解的基础上，重点采用胰蛋白酶酶解，探讨热处理对过氧自由基氧化米糠蛋白体外胰蛋白酶消化性质的影响，以期更全面地认识热处理和氧化过程中蛋白质的变化，同时为米糠的进一步研究及综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脱脂米糠、AAPH、胃蛋白酶(900 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg)、肽分子质量标准品(色谱纯)、ABTS(分析纯)，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

K9840自动凯氏定氮仪、色谱柱TSKgel SW G2000 SWXL(300 nm×7.8 nm)、LC-20液相色谱仪、BlueStar紫外可见分光光度计。

1.3 试验方法

1.3.1 米糠蛋白的制备

以脱脂米糠为原料，参考蔡勇建等[8]方法，按照1∶10(g∶mL)的料液比将脱脂米糠与去离子水混合后置于40 ℃条件下搅拌提取4 h，期间用2 mol/L NaOH调pH值至9.0，搅拌结束后离心20 min(4 ℃，8 000 r/min)，用2 mol/L HCl将上清液的pH调至4.0以沉淀蛋白，静置一段时间后离心15 min(4 ℃，8 000 r/min)，用少量去离子水溶解沉淀并将pH调到7.0，最后冷冻干燥制得纯度为83.75%的米糠蛋白。

1.3.2 过氧自由基氧化米糠蛋白的制备

参考尤翔宇等[5]方法，用含0.5 mg/mL NaN3的0.01 mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液溶解1.3.1中制得的米糠蛋白粉末得到10 mg/mL的蛋白溶液，往该混合液中添加一定量的AAPH使其浓度为0、0.1、1、3、6和10 mmol/L，在37 ℃下搅拌反应24 h。随后将溶液装入洁净的透析袋，透析24 h除去残留的AAPH，冷冻干燥后得到过氧自由基氧化米糠蛋白。

1.3.3 热处理过氧自由基氧化米糠蛋白的制备

用去离子水溶解1.3.2中的过氧自由基氧化米糠蛋白得到2%的蛋白溶液，分两组。其中一组在37 ℃水浴30 min，另一组在95 ℃水浴30 min，然后将两组溶液放置在37 ℃下水浴15 min，备用。

1.3.4 米糠蛋白体外胰蛋白酶消化率的测定

参考Chen等[9]方法，采用胃蛋白酶-胰蛋白酶两步酶解法处理过氧自由基氧化米糠蛋白。取1.3.3中样品，在37 ℃下用2 mol/L HCl将pH调到2.0，加入4 U/mg胃蛋白酶反应1.5 h，2 mol/L NaOH溶液将pH调至7.0，加入4 U/mg胰蛋白酶反应3 h，沸水浴5 min使胰蛋白酶失活，离心10 min(4 ℃，10 000 r/min)后取上清液，采用凯氏定氮法测定上清液的肽浓度。将剩余上清液浓度稀释至0.6 mg/mL，以测定米糠蛋白胰蛋白酶消化产物分子质量分布和抗氧化性。

1.3.5 米糠蛋白体外胰蛋白酶消化进程的测定

取1.3.3中样品，用2 mol/L HCl调节pH值到2.0，加入4 U/mg胃蛋白酶，37 ℃下保温酶解90 min，用2 mol/L NaOH溶液将消化液pH调至7.0，加入4 U/mg胰蛋白酶，37 ℃下酶解0、10、20、40、60、80、120和180 min后加入三氯乙酸溶液终止反应。随后离心15 min(4 ℃，8 000 r/min)，取上清液测定OD280值。为表征米糠蛋白体外胰蛋白酶消化进程，参考Bax等[10]方法引入拟合指数曲线方程和半衰期方程：

1/OD=1/ODmax×eβ(1/t)t1/2=β/ln

(2)

式中：ODmax为完全消化时的最大OD值；β为曲线形状系数；t1/2为达到ODmax的一半所需的消化时间。

1.3.6 米糠蛋白体外胰蛋白酶消化产物分子质量测定

参考Chen等[9]方法稍作修改，将肽分子质量标准品配制成1 mg/mL的蛋白溶液，采用高效液相色谱仪分析。取1.3.4中得到的浓度一致的上清液过膜，收集滤液，采用高效液相色谱仪分析样品。其中色谱柱：TSKgel SW G2 000 SWXL(300 nm×7.8 nm)；检测器：紫外检测器；流动相：0.1 mol/L、pH 6.8含0.1 mol/LNa2SO4的磷酸盐缓冲液；检测波长：220 nm；流速：0.5 mL/min；柱温：25 ℃。将标准品经凝胶色谱柱测定，最后得到标准曲线y=-0.237 1x+7.157 7(R2=0.985 6)。

1.3.7 米糠蛋白体外胰蛋白酶消化产物抗氧化活性测定

1.3.8 数据处理与统计分析

所有实验平行测定3次，结果均以“均值±标准偏差”表示。数据处理采用Microsoft excel 2007，显著性分析采用IBM SPSS Statistics 24。采用最小显著差异法进行指标比较，取95%置信度(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 热处理对过氧自由基氧化米糠蛋白体外胰蛋白酶消化率的影响

热处理对过氧自由基氧化米糠蛋白体外胰蛋白酶消化率的影响如图1所示，随着AAPH浓度的增加，未热处理和热处理的氧化米糠蛋白体外胰蛋白酶消化率均先增加后下降，在AAPH浓度为1 mmol/L时分别到达最大值74.12%和81.11%。Zhou等[14]采用亚油酸氧化猪肌原纤维蛋白，结果发现低浓度的亚油酸有助于增强肌原纤维蛋白的柔性并提高其消化率；而高浓度的亚油酸会诱导肌原纤维蛋白形成聚集体，对胃蛋白酶酶解肌原纤维蛋白产生负面影响。尤翔宇等采用过氧自由基氧化米糠蛋白探究氧化对米糠蛋白体外胃蛋白酶消化性质的影响[6]，研究结果中胃蛋白酶消化率的变化趋势与本研究中胰蛋白酶消化率的变化趋势一致，结合过氧自由基氧化对米糠蛋白结构的影响可以推断[5]，低浓度的过氧自由基可以使米糠蛋白的空间结构展开，暴露出更多的蛋白酶结合与识别位点，提高米糠蛋白的消化率；而高浓度的过氧自由基则会诱导蛋白质氧化聚集体的形成，掩蔽米糠蛋白中部分蛋白酶的结合与识别位点，导致米糠蛋白消化率下降。同时，与米糠蛋白体外胃蛋白酶消化率相比[6]，本研究中体外胰蛋白酶消化率显著升高，这可能是由于胰蛋白酶的进一步消化作用。

注：同一柱状图中不同字母表示显著性差异(P<0.05)，下同。图1 热处理对过氧自由基氧化米糠蛋白体外胰蛋白酶消化率的影响

与未热处理相比，热处理提高了相同氧化程度下米糠蛋白体外胰蛋白酶的消化率。有研究表明，热处理能提高胰蛋白酶酶解苦荞蛋白的速度，并改善苦荞蛋白消化率，原因主要是热处理使苦荞蛋白紧密的结构变得疏松，暴露出部分隐藏在苦荞蛋白内部的胰蛋白酶结合与识别位点[15]。由此推测，在相同氧化程度下，热处理会使蛋白质的结构展开，改变蛋白质分子酶解位点的数量，进而改善米糠蛋白的消化率。随着AAPH浓度的增加，热处理后氧化米糠蛋白体外胰蛋白酶消化率的提升幅度逐渐减小，这可能是因为高浓度的过氧自由基会促进蛋白质分子间通过非二硫键的共价交联形成氧化聚集体，热处理难以破坏此类氧化聚集体的结构，使得热处理提升氧化蛋白消化率的幅度有限[16]。

2.2 热处理对过氧自由基氧化米糠蛋白体外胰蛋白酶消化进程的影响

未热处理和热处理的过氧自由基氧化米糠蛋白体外胰蛋白酶消化进程如图2所示，拟合曲线具体参数见表1。相同氧化程度下，氧化米糠蛋白OD280值随消化时间的增加而升高，前80 min增长较快而后逐渐趋于平缓，与尤翔宇等[6]研究过氧自由基氧化对米糠蛋白体外胃蛋白酶消化性质影响得到的OD280值变化趋势相似。未热处理和热处理的氧化米糠蛋白ODmax值具有相同的趋势：随着AAPH浓度的增加，ODmax值先增大后减小，在AAPH浓度为1 mmol/L时分别达到最大值0.201和0.227。同未热处理相比，热处理显著提高了相同氧化程度下米糠蛋白的ODmax值。

图2 热处理对过氧自由基氧化米糠蛋白体外胰蛋白酶消化进程的影响

为了进一步确定热处理对过氧自由基氧化米糠蛋白体外胰蛋白酶消化进程的影响，以半衰期t1/2相对应的OD280值计算初始消化速率，结果如图3。随着AAPH浓度的增加，氧化米糠蛋白体外胰蛋白酶初始消化速率先升高后降低，在AAPH浓度为1 mmol/L时分别到达最大值0.230 ΔOD280/h和0.259 ΔOD280/h。该结果与Sun等[17]关于蛋白质氧化程度与蛋白初始消化速率之间关系的研究结果一致。同未热处理相比，热处理显著提高了相同氧化程度下米糠蛋白体外胰蛋白酶初始消化速率。周志红等[18]研究发现一定的湿热处理(80 ℃，30～60 min)能显著提高大豆分离蛋白体外胰蛋白酶消化的效果，与本实验结果一致。这表明了氧化和热处理均会改变米糠蛋白的结构，导致米糠蛋白暴露于微环境中的蛋白酶结合与识别位点数目发生变化，进而影响蛋白质的胰蛋白酶消化进程。

表1 过氧自由基氧化对米糠蛋白体外胰蛋白酶消化进程拟合曲线参数的影响

图3 热处理对过氧自由基氧化米糠蛋白体外胰蛋白酶初始消化速率的影响

2.3 热处理对过氧自由基氧化米糠蛋白体外胰蛋白酶消化产物分子质量分布的影响

热处理对过氧自由基氧化米糠蛋白体外胰蛋白酶消化产物分子质量分布的影响见表2。从表2可以看出，米糠蛋白胰蛋白酶消化产物分子质量主要分布在1 500 u内，且集中分布于0～500 u之间，与Wattanasiritham等[19]采用胰蛋白酶水解米糠蛋白得到的肽分子质量分布情况类似。随着AAPH浓度的增加，氧化米糠蛋白体外胰蛋白酶消化产物分子质量分布在500～1 500 u内的肽含量呈现先增多后减少的趋势，在AAPH浓度为1 mmol/L时分别达到最大值4.00%和6.03%。与未热处理相比较，热处理提高了相同氧化程度下米糠蛋白胰蛋白酶消化产物分布在500～1 500 u内的多肽含量。姜竹茂等[20]的研究表明，牛乳蛋白消化产物分子质量主要分布在低于1 500 u内，且多肽含量随热处理时间的增加而增加。由此推测，经过热处理的过氧自由基氧化米糠蛋白在胰蛋白酶水解作用下会生成更多的低分子质量消化产物。

表2 过氧自由基氧化对米糠蛋白胰蛋白酶消化产物分子质量分布的影响

2.4 热处理对过氧自由基氧化米糠蛋白体外胰蛋白酶消化产物抗氧化活性的影响

表3 热处理对过氧自由基氧化米糠蛋白体外胰蛋白酶消化产物抗氧化性的影响

注：同一行不同字母表示显著性差异(P<0.05)。

3 结论