24-表油菜素内酯调控活性氧代谢增强杏果实采后抗病性

石 玲，李丽花，张瑞杰，李亚玲，李 玲，张 昱，廖海慧，朱 璇*

（新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

杏（Prunus armeniacaL.）属蔷薇科李属。据2018年数据统计，新疆杏树种植面积约为12万 hm2，产量达115万 t，占全疆水果总种植面积的12.12%、总产量的11.37%[1]。杏在采后贮运过程中易遭受到病原微生物的侵染而发生腐烂，造成严重的采后损失，其中由链格孢菌（Aletrnaria aletrnata）引起的杏黑斑病是杏果实主要的采后病害[2]。目前，主要采用化学杀菌剂控制杏果实黑斑病的发生，但由于其安全性和残留危害等问题而受到限制[3]。

油菜素内酯是一种重要的植物甾醇类激素，已被公认为是第6类植物激素，在植物体内含量极低，但生理活性极高。有研究表明，油菜素内酯在抵抗各种异常的温度、干旱、高渗透压及病原菌侵袭的过程中发挥了十分重要的作用[4]。Noreen[5]研究发现油菜素内酯可调控棉花对黄萎病菌抗性，增强甜瓜叶片等植物的耐热性[6-7]。在采后果蔬的研究中发现，外源油菜素内酯处理可以提高茄子[8]和草莓[9]果实的抗氧化性，减轻桃[10]、杏[11]和香蕉[12]果实贮藏期间冷害的发生。张正敏等[13]研究发现24-表油菜素内酯（24-epibrassinolide，EBR）处理抑制桃果实采后软腐病的发生与其维持较高的能荷水平有关。李丽花等[14]研究表明EBR有可能通过诱导杏果实苯丙烷代谢增强来提高果实对A. alternata的抗病性。

活性氧代谢在果蔬成熟、衰老及采后抗病性等方面发挥着重要作用。病原侵入后，寄主最快的抗病反应就是产生大量的活性氧，主要包括超氧阴离子自由基（O2-·）、H2O2等[15-16]。近年来的研究推测活性氧可能作为一种植物胞内信号分子激发相关抗性酶活性的增加，参与植物的抗性活动[17-18]。研究表明，水杨酸、茉莉酸甲酯、苯并噻二唑等处理诱导采后芒果[19]、枇杷[20]、桃[21]果实抗病性增强，均与其对活性氧的调控密切相关。研究发现，采后香蕉果实经热处理诱导产生耐冷性也与果皮活性氧的迅速积累和引起的防御反应有密切关系[22]。

果蔬抗病性的效果因生物调节剂的种类、浓度、果蔬种类、诱导时间及诱导处理方法的不同而不同。目前EBR处理诱导抗病性的研究多数集中在作物对真菌和细菌的抗性，然而关于EBR处理对杏果实采后病害控制的抗病性与活性氧代谢关系还鲜见报道。针对上述问题，本研究以杏果实为实验材料，结合透射电子显微镜观察杏果实超微结构，主要探究EBR（目前市售活性最强的一种）处理对杏果实采后活性氧代谢、抗病性及超微结构的影响，以期完善油菜素内酯处理增强果实采后抗病性的理论，并为该处理应用实践提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

‘赛买提’杏果实于2018年6月23日采自新疆库车县乌恰镇杏果园，剔除有机械损伤和病虫害的杏果实，选取成熟度（可溶性固形物质量分数12%～13%、硬度（18.0±0.5）N）、大小相近的杏果实，套发泡网装箱后，当天运回，于通风阴凉处除去田间热。

用于杏果实损伤接种的病原菌A. alternata，由新疆农业大学微生物实验室提供。

所有试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

AL204-IC电子分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司;UV-1700紫外-可见分光光度计 上海美析仪器有限公司;FW-80高速万能粉碎机 广州仪科实验室技术有限公司;SHB-III循环水式多用真空泵郑州长城科工贸有限公司;3H16RI智能高速冷冻离心机湖南赫西仪器装备有限公司;DZKW-S-6电热恒温水浴锅北京市永光明医疗仪器厂;JEOLTEM-1230型电子显微镜日本电子公司。

1.3 方法

1.3.1 原料处理与分组

参照本课题组前期的研究[14]，选择0.9 mg/L作为EBR处理质量浓度。溶液配制方法：用2.0 mL无水乙醇溶解1.80 mg EBR，然后用蒸馏水定容至2 L，即配制好的0.9 mg/L EBR溶液含体积分数0.1%乙醇。

实验分为实验组和处理组，对浸泡在EBR溶液中的杏果实进行抽气减压处理，在0.05 MPa下保持2 min后于常压下浸泡5 min（处理组），以含体积分数0.1%乙醇的蒸馏水进行抽气减压处理的杏果实作为对照组。每组设3 个平行，每个平行3 kg杏果实。自然晾干后置于温度（1.0±0.5）℃、相对湿度90%～95%的冷库中贮藏48 h后进行损伤接种处理。

1.3.2 损伤接种

参照Deng Lili等[23]的方法并稍作修改。取在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）培养7 d的A. alternata，加入含有0.05% Tween-80的无菌水20 mL，用无菌药匙刮下PDA上的孢子，转移到50 mL三角瓶内，摇匀后用纱布滤除大块絮状物，将A. alternata孢子浓度调节至1×106个/mL。先用无菌水擦拭杏果实的表皮并晾干，再用体积分数75%的乙醇溶液擦洗消毒。晾干后用灭菌的铁钉在杏果实纵向中心线两侧等间距穿刺2 个直径2 mm、深5 mm的孔洞，每个孔洞分别注入15 μL孢子悬浮液，损伤接种后，将果实放入筐中套好保鲜袋于温度（1.0±0.5）℃、相对湿度90%～95%的冷库中贮藏。定期取样观察测定相关指标。

1.3.3 指标测定

1.3.3.1 发病率及病斑直径的测定

定期记录贮藏期间各组出现病害的杏果实发病孔数（病斑直径大于3 mm记为发病孔数），发病率按下式计算。

将接种部位果皮削去，用直尺在病斑处进行十字交叉法测量病斑直径/mm。

1.3.3.2 H2O2含量、过氧化氢酶活力的测定

H2O2含量、过氧化氢酶（catalase，CAT）活力的测定参照曹建康等[24]的方法。H2O2含量单位为μmol/g，结果以鲜质量计;以每克鲜杏组织在240 nm波长处每分钟吸光度变化0.01表示1 个CAT活力（U）。

1.3.3.3 O2-·产生速率和超氧化物歧化酶、过氧化物酶活力的测定

O2-·产生速率的测定参照曹建康等[24]的方法，以每分钟每克鲜质量杏组织产生O2-·物质的量为O2-·产生速率，单位为nmol/（min·g）。

超氧化物歧化酶活力（superoxidedismutase，SOD）活力的测定参照曹建康等[24]的方法，以每克杏果实每分钟在240 nm波长处吸光度增加0.01为1 个SOD活力单位（U）。

过氧化物酶（peroxidase，POD）活力参照朱广廉等[25]的方法，以每克鲜质量杏组织在470 nm波长处吸光度每分钟增加1为1 个POD活力单位（U）。

1.3.3.4 丙二醛含量、细胞膜渗透率的测定

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、细胞膜渗透率的测定参照曹建康等[24]的方法，丙二醛含量单位为nmol/g。

1.3.3.5 超微结构的测定

由于杏果实贮藏期间的前期和中期以及末期对比差异比较明显，因此在杏果实采收当天和贮藏的第28、42天分别取样。用双面刀片取杏果实病-健交界处果肉切成1 mm×1 mm×2 mm的块状，每次取样的部位保持一致。

样品用体积分数2.5%戊二醛溶液固定14 h后，用0.1 mol/L pH 7.2磷酸盐缓冲液浸泡清洗样品，浸泡时间为10 min，浸泡清洗3 次。然后用体积分数1%～2%锇酸固定1 h，以确保组织浸入锇酸中。锇酸固定后，用蒸馏水清洗3 次，每次10 min，之后用醋酸铀染色1.5 h。再用体积分数50%、70%、80%、90%、100%乙醇溶液依次进行梯度脱水，之后用纯丙酮置换20 min。置换后用包埋剂浸润组织之后进行聚合，最后使用LeicaUC切片机切成60 nm的薄片，再用JEOLTEM-1230型电子显微镜拍照。

1.4 数据处理与分析

使用SigmaPlot 12.0软件整理数据并制图，利用SPSS 22.0软件对数据进行方差分析，采用Duncan’s进行差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 EBR处理对杏果实接种A. alternata病斑直径及接种发病率的影响

图 1 EBR处理对杏果实接种后发病率（A）及病斑直径（B）的影响Fig. 1 Effect of EBR treatment on disease incidence (A) and lesion diameter (B) in inoculated apricot fruit

如图1所示，在接种后的贮藏期间，杏果实接种发病率呈现不断增长的趋势，但对照组杏果实接种发病率一直高于EBR处理组。第35天，EBR处理组杏果实接种发病率是对照组杏果实接种发病率的53.25%（P＜0.05）;同时，EBR处理组杏果实病斑直径一直低于对照组，贮藏第28天，对照组和EBR处理组杏果实病斑直径分别为8.50 mm和5.10 mm，对照组杏果实病斑直径比EBR处理组高66.67%（P＜0.05）。

2.2 EBR处理对杏果实H2O2含量及CAT活力的影响

图 2 EBR处理对杏果实H2O2含量（A）、CAT活力（B）的影响Fig. 2 Effect of EBR treatment on H2O2 content (A) and CAT activity (B) in apricot fruit

如图2A所示，杏果实损伤接种A. alternata后，H2O2迅速积累。在贮藏第14天，对照组杏果实H2O2含量达到累积高峰值，为3.00 μmol/g，EBR处理组杏果实在贮藏第21天时，H2O2含量达到累积高峰值（3.52 μmol/g），高于同期对照组30.17%（P＜0.05），较对照组推迟7 d达到H2O2含量的累积高峰，同时在贮藏21 d后，EBR处理组杏果实H2O2含量缓慢下降，最终低于对照组。

如图2B所示，杏果实接种A. alternata后，在贮藏前期EBR处理组杏果实CAT活力低于对照组杏果实。在贮藏14～21 d，EBR处理组杏果实CAT活力提高24.57%。在贮藏21 d后，EBR处理组杏果实中CAT活力显著高于对照组杏果实。在贮藏42 d时EBR处理组杏果实CAT活力为2.05 U，是对照组杏果实的1.27 倍（P＜0.05）。

2.3 EBR处理对杏果实O2-·产生速率的影响

图 3 EBR处理对杏果实O-2·产生速率的影响Fig. 3 Effects of EBR treatment on O2-· production rate of apricot fruit

由图3可知，杏果实O2-·产生速率在接种后的贮藏过程中迅速上升，并且第21天达到最大值，此时对照组杏果实O2-·产生速率为669.33 nmol/（min·g），EBR处理后的杏果实O2-·产生速率低于对照组杏果实23.46%。在贮藏到第42天，对照组杏果实O2-·产生速率比EBR处理组高20.80%（P＜0.05）。

2.4 EBR处理对杏果实SOD、POD活力的影响

图 4 EBR处理对杏果实SOD（A）、POD（B）活力的影响Fig. 4 Effect of EBR treatment on SOD (A) and POD (B) activity of apricot fruit

如图4A所示，杏果实损伤接种A. alternata后，在贮藏期间SOD活力呈现先上升后下降的趋势，且EBR处理组杏果实SOD活力显著高于对照组杏果实。在贮藏第14天，对照组和EBR处理组杏果实SOD都达到活力高峰，分别为1.217 3 U和1.278 1 U。说明EBR处理能够有效提高杏果实采后贮藏过程中SOD活力。

如图4B所示，随着贮藏时间的延长，杏果实POD活力呈现逐渐上升的趋势。在整个贮藏过程中，EBR处理组杏果实POD活力一直高于对照组杏果实。在贮藏的第7天，EBR处理组杏果实POD活力比对照组杏果实高28.99%。在贮藏的第42天，EBR处理组杏果实POD活力为5.02 U，比对照组高15.67%（P＜0.05）。

2.5 EBR处理对杏果实MDA含量和细胞膜渗透率的影响

如图5A所示，杏果实MDA含量随贮藏时间的延长呈现逐渐上升的趋势，EBR处理组的杏果实MDA含量始终显著低于同期对照组，且在21 d后差异显著（P＜0.05）。在贮藏第35天时，对照组杏果实MDA含量为0.92 nmol/g，比同期EBR处理组高37.31%（P＜0.05）。表明EBR处理可有效抑制杏果实采后损伤接种A. alternata后的MDA含量上升。

由图5B可知，杏果实细胞膜渗透率随着贮藏时间延长呈逐渐上升趋势，EBR处理组杏果实细胞膜渗透率始终低于对照组，且在14 d以后差异显著（P＜0.05）。贮藏第35天，对照组杏果实细胞膜渗透率为63.70%，比EBR处理组高35.56%（P＜0.05）。说明EBR处理可有效抑制杏果实采后损伤接种A. alternata后的细胞膜渗透率上升。

图 5 EBR处理对杏果实MDA含量（A）和细胞膜渗透率（B）的影响Fig. 5 Effects of EBR treatment on MDA content (A) and cell membrane permeability (B) in apricot fruit

2.6 EBR处理对杏果实对细胞超微结构的影响

图 6 杏果实采收当天细胞超微结构Fig. 6 Cell ultrastructure of apricot fruit on the day of harvest

从图6A可以看出，杏果实在采收当天细胞整体结构清晰且完整，各细胞器结构无损，细胞器间膜结构清晰可见;液泡的体积占整个细胞的80%以上，液泡与各细胞器之间的膜清晰且完整。图6B、C显示出叶绿体双层膜结构完整，嗜锇颗粒在叶绿体中分布均匀且清晰，具有完整的内部结构;细胞核及内质网膜结构明显。由图6D可知，细胞壁结构完整，无细胞间隙，与细胞质紧贴;细胞质形态正常，含有大量细胞器，如线粒体和叶绿体。

杏果实贮藏第28天细胞超微结构发生了明显改变（图7）。如图7A所示，贮藏28 d后，EBR处理组的杏果实细胞结构较对照组明显完整，胞内囊泡膨胀增大;叶绿体双层膜结构模糊，叶绿体形状开始改变，并且基粒片层和基质片层结构模糊，嗜锇颗粒增大;液泡结构发生改变，液泡膜边缘模糊;线粒体较完整，数量较多。由图7B可知，贮藏28 d后，对照组杏果实液泡形状变化明显，液泡膜降解，形成絮状孔洞;细胞质呈絮状，细胞开始出现扭曲，各细胞器膜皱缩，细胞器数量明显减少，细胞囊泡化严重;线粒体数量明显减少，出现孔洞化，且膜结构模糊;叶绿体膜结构破坏，无明显形态。

图 7 杏果实贮藏第28天细胞超微结构Fig. 7 Cell ultrastructure of apricot fruit after 28 days of storage

由图8A可知，杏果实贮藏42 d后，EBR处理的杏果实也出现细胞器细胞壁变形，细胞壁也出现质壁分离的现象，细胞器膜及液泡膜均发生降解。由图8A4可知，杏果实细胞内各细胞器无规则排列，细胞质呈现絮状沉淀，细胞间隙明显且增大，叶绿体和线粒体等细胞器双层膜结构消失，但与对照组相比仍清晰可见。如图8B1、B2所示，杏果实贮藏42 d后，对照组杏果实中各细胞器解体并与细胞质混合，且呈现出絮状，细胞壁扭曲变形，质壁分离严重;液泡呈现无规则形态，液泡膜破损降解;叶绿体双层膜结构消失，嗜锇颗粒极少，呈明显的空腔化;细胞内结构破坏严重，细胞器及细胞质浑浊（图8B3）。细胞内含物大量减少，大量细胞器降解消失，出现明显的质壁分离，囊泡和细胞间隙明显增多（图8B4）。

3 讨 论

研究表明，果实体内活性氧代谢与果实抗病性密切相关，植物细胞在受到病原菌等胁迫时，能激发H2O2的产生，并以此来调控一系列应答胁迫的信号传导，启动寄主的防御反应，而且H2O2对病原菌增殖具有一定抑制作用[26]。本实验中，在接种前期EBR处理能有效抑制杏果实CAT活力，促进H2O2积累，H2O2作为信号分子，激活杏果实SOD、POD等抗病相关酶活力，诱导果实增强抗病性。这与Xia Xiaojian[27]和杨艺琳[28]等的研究结果一致，以上研究均表明H2O2作为信号分子在EBR诱导抗性中发挥着重要作用，其前期持续的高含量提高了生物体抵抗病原菌入侵的应激防御能力。但自由基的过度累加会加剧膜脂过氧化，造成细胞膜脂系统的损伤[29]，本实验中，杏果实EBR处理组SOD活力始终高于对照组，且在接种后期EBR处理组CAT活力明显高于对照组，因此有效避免了H2O2和O2-·过度累积对果实产生的伤害。MDA含量可衡量细胞膜脂过氧化程度[30]，本实验中EBR处理诱导杏果实酶促防御体系SOD、POD等抗氧化酶活力的增加，有效抑制膜脂过氧化作用，使处理组杏果实保持较低细胞膜渗透率和MDA含量，这也有助于增强杏果实的抗病性。EBR处理诱导葡萄叶片抵御霜霉病和葡萄果实抵抗灰霉病[31]、大白菜抗软腐病[32]，壳聚糖诱导脐橙抵抗青霉病[33]的实验结果也表明果蔬抗病性的增强与H2O2快速积累和抗病相关酶SOD、POD等活力增强有密切关系。

细胞是生物体最基本的结构和功能单位[34]，观察果实细胞超微结构变化，对于研究果实采后生理[35]和抗病性[36]具有重要意义。本实验对杏果实超微结构的观察发现，EBR处理能有效地维持杏果实细胞壁和线粒体、叶绿体等结构的完整性和稳定性，对增强杏果实抗病性具有积极作用，荣瑞芬等[37]观察发现UV-C照射采后番茄果皮能延缓叶绿体等细胞器解体，可提高番茄果实对A. alternata的抗性。EBR处理增强杏果实采后抗病性的原因可能是多方面的，其机理有待进一步研究。

4 结 论

0.9 mg/L的EBR处理可较好维持杏果实在贮藏期间细胞壁和线粒体、叶绿体等结构的完整性，延缓杏果实细胞膜渗透率和发病率的上升，显著抑制病斑直径和MDA含量的增加，增强了杏果实中SOD、POD和接种后期CAT等抗性相关酶活力，能有效提高杏果实前期H2O2含量的积累，减缓·的产生速率，较好地调控杏果实体内活性氧代谢，增强杏果实抗病性。