姜荷花叶绿素降解酶基因PAO的分离及特征

刘建新 王国夫 许 骅 丁华侨

(1.绍兴文理学院 元培学院,浙江 绍兴 312000；2.浙江省萧山棉麻研究所,浙江 杭州 311202)

姜荷花(Curcumaalismatifolia)为姜科姜黄属多年生球根草本花卉，原产于泰国清迈等地，又被称为“暹罗郁金香”或“热带郁金香”[1].花期长达3个月以上，在我国华东地区，花期从7月下旬至10月下旬.姜荷花为穗状花序，上部苞叶为粉红色阔卵形不育苞片(苞片颜色依品种而定，此处为品种“清迈粉”的色彩)，下部为蜂窝状绿色可育苞片，内含紫白色小花，花姿温婉如莲[2].然而大多数姜荷花品种的不育苞片尖端都存在叶绿素沉着的绿尖现象，同时在绿尖下面存在着红色色素的沉着，此为“绿尖红底”现象(图1).它跟环境的光照强度密切相关，全日照露天生长时非常明显，而遮阴生长时则比较浅.此现象的出现使得姜荷花苞片呈现出焦灼感，严重影响美观，而降低了观赏价值.叶绿素构成的绿色部分在“绿尖红底”现象形成过程中起了非常重要的作用，因此采取措施降低苞片中叶绿素的含量，有利于抑制或减轻“绿尖红底”现象.脱镁叶绿酸a加氧酶(pheophorbide a oxygenase，PAO)是叶绿素降解代谢的关键酶[3-5].叶绿素经PAO降解后可将绿色最终消失，方法是往叶绿素中加入两个氧原子，打开卟啉环，形成红色的叶绿素降解物(四元线性吡咯衍生物)[6].前人的研究表明，PAO普遍存在于高等植物基因组，其参与的叶绿素的降解已经证明在绿色植物代谢过程中广泛存在[7]，PAO基因的表达与细胞衰老密切相关[8].目前已在烟草(Nicotianatabacum，NM_001325995.1)、拟南芥(Arabidopsisthaliana，NM_114357.6)、辣椒(Capsicumannuum，NM_001324641.1)、枫香(Liquidambarformosana，JX975397.1)、甘蓝型油菜(Brassicanapus，DQ388373.1)、锦鸡儿(Elaeisguineensis，XM_010920415.3)、家蝇(Malusdomestica，XM_008387276.3)、潘那利番茄(Solanumpennellii，XM_015202725.2)等植物中被克隆获得，但未见有关于姜荷花叶绿素降解代谢关键酶基因方面PAO的报道.本研究目的在于获得叶绿素降解的关键酶基因PAO信息，为后期改良姜荷花不育苞片的颜色提供基础，同时对进一步丰富和探索叶绿素降解代谢理论提供铺垫.

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为姜荷花品种“清迈粉”开花植株的全长转录组数据库.笔者前期以“清迈粉”的茎、叶、不育苞片、可育苞片及小花苞作为混合材料取样， 基于Pacbio法进行了全长转录组(PBIsoSeq)的测序，共计获得姜荷花转录组信息64 471条，并进行了相应的注释，相关数据另文刊出.

图1 姜荷花“绿尖红底”焦灼现象

1.2 PAO1和PAO2的获得

根据转录组数据库的注释信息，找出注释为pheophorbide a oxygenase的信息，进行序列分析、比对、筛选，PCR验证等，获得PAO1和PAO2基因.

1.3 PAO1和PAO2基因生物信息学分析

采用生物信息学方法对获得的PAO1和PAO2基因的cDNA核苷酸序列、蛋白氨基酸的一级结构、二级结构、三级结构进行研究分析.具体而言，进行了核苷酸比对(BlastN)、蛋白氨基酸比对(BlastP)、多序列比对(Clustal Omega)、蛋白氨基酸序列预测(ExPASy的Translate tool)、保守区查找(NCBI的Find conserved domains)、理化特征分析(ProtParam)、蛋白跨膜结构预测(TMHMM Server v. 2.0)、二级结构预测(SOPMA)[9]、三级晶体结构模型预测(SWISS-MODEL)[10]等.最后，采用BlastP、ClustalX(1.81)及MEGA4.1进行了分子进化分析，即先进行BlastP在线比对获得一致性较高的其他物种的PAO蛋白氨基酸序列信息，再用获得的序列进行多序列比对，最后再生成分子系统树来分析亲缘关系.

2 结果与分析

2.1 PAO1和PAO2的获得

从数据库中筛选出注释为pheophorbide a oxygenase信息8条，其中1-2K的6条，2-3K的2条.将其进行核苷酸和推定氨基酸的多序列比对(Clustal Omega)以消除重复序列，然后进行核苷酸和推定氨基酸的BlastN和BlastP在线比对，最终获得了两条高质量的pheophorbideaoxygenase基因信息，分别命名为PAO1和PAO2(图2).

PAO1的全长cDNA序列长1 794 bp，GenBank登录号为MT077180.PAO2的全长cDNA序列长1 843 bp，GenBank登录号为MT077181.PAO1和PAO2的一些序列特征完全一致，如开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)都是从10 bp 到1 620 bp，氨基酸数都为536AA(Amino acid)，起始密码子和终止密码子分别是ATG和TGA.

将PAO1和PAO2的cDNA序列进行Clustal Omega比对可知PAO2主要是在5’端多了48个碱基，其余共同的部分存在13个碱基的差异，其中在CDS区存在8个碱基的差异.将PAO1和PAO2的氨基酸序列进行Clustal Omega比对可知(图3)，两者的氨基酸序列的数量绝大部分相同，仅4个氨基酸存在差异.

2.2 PAO1和PAO2全长cDNA序列的BlastN分析及氨基酸序列的BlastP分析

对PAO1基因的cDNA全长序列进行BlastN比对，可知与小果野芭蕉(Musaacuminatasubsp.malaccensis)、油棕(Elaeisguineensis)、海枣(Phoenixdactylifera)、高粱(Sorghumbicolor)、玉米(Zeamays)、短花药野生稻(Oryzabrachyantha)、霍氏黍(Panicumhallii)、小米(Setariaitalica)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、菠萝(Ananascomosus)、芦笋(Asparagusofficinalis)等的PAO基因有较高的同源性.其中与小果野芭蕉(XM_009399766.2)同源性最高，为84.72%.将PAO1基因蛋白氨基酸序列进行BlastP在线比对分析，可知它与小果野芭蕉的|XP_009398041.1|一致性最高，达到86.63%.

同理，将获得的PAO2基因全长cDNA序列进行核酸同源性(BlastN)比对，发现与小果野芭蕉(Musaacuminatasubsp.Malaccensis)、油棕(Elaeisguineensis)、海枣(Phoenixdactylifera)、高粱(Sorghumbicolor)、玉米(Zeamays)、短花药野生稻(Oryzabrachyantha)、霍氏黍(Panicumhallii)、小米(Setariaitalica)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)等的PAO基因有较高的同源性.其中与小果野芭蕉(XM_009399766.2)、油棕(XM_010923945.3)的一致性最高，分别为84.65%和80.16%.然后将PAO2的蛋白序列进行BlastP在线比对分析，可知它与小果野芭蕉的XP_009398041.1一致性最高，达到86.63%.

2.3 PAO1和PAO2推定蛋白氨基酸的一、二、三级结构特征分析及预测

采用在线ProtParam对推定的PAO1氨基酸序列的理化性质进行预测分析，其相对分子质量(Relative molecular mass)为60.04 kD，正负电荷氨基酸残基分别为55个(Arg + Lys) 和51个(Asp + Glu)，等电点pI(Isoelectric point)为8.35.使用TMHMM Server v. 2.0进行在线跨膜预测，表明为膜外蛋白(outside)，但在500 AA附近可能存在着两个跨膜螺旋结构(图4)，与使用Phobius prediction进行跨膜结构预测得到的结果一致(http://phobius.sbc.su.se/).用SOPMA在线预测其二级结构，可知主要由15.49%的延伸链(extend strand)、 27.80%的Alpha螺旋 (alpha helix) 和50.12%随机卷曲(random coil)组成.

同样，采用在线ProtParam对推定的PAO2氨基酸序列的理化性质进行预测分析，其相对分子质量(Relative molecular mass)为59.99 kD，正负电荷氨基酸残基分别为55个 (Arg + Lys) 和51个(Asp + Glu)，等电点pI(Isoelectric point)为8.35，PAO2正负电荷氨基酸残基和等电点与PAO1的相同.使用TMHMM Server v. 2.0和Phobius prediction进行在线跨膜预测，PAO2与PAO1结构无明显差别.用SOPMA在线预测其二级结构，可知主要由50.12%的15.86%的延伸链(extend strand)、28.54%的Alpha螺旋(alpha helix)和50.75%随机卷曲(random coil)组成.将PAO1和PAO2在NCBI 上进行利用Specialized Blast工具进行保守区分析[11].发现两者都包含有PLN02518超家族保守区，该保守区是pheophorbide a oxygenase 的特征[12].还包含有Rieske_RO_Alpha_PAO和PAO保守区.将PAO1蛋白氨基酸序列提交到 SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)，并在蛋白质结构库中搜寻模板，最终发现PAO1蛋白序列的第83～430残基与3gob.1的A链序列一致性达到22.36%，然后以3gob.1的A链为模板预测PAO1蛋白的三维模型[13]，结果如图5-A所示.此外，也用第82～460残基与一致性为17.11%的4qdf.1的A链作为模板预测PAO1蛋白的三维模型，结果如图5-B所示.PAO2的结构与PAO1结构基本相似，两者仅存在4个氨基酸残基的差异，因此无须另行预测.

2.4 分子系统进化分析

对获得的PAO1和PAO2及其他物种的PAO蛋白氨基酸序列用ClustalX(1.81)软件进行多个氨基酸序列的比对，构建分子系统树(MEGA4.1软件)(图6).结果表明，PAO1和PAO2聚为一小类，与小果野芭蕉(XP_009398041.1)的亲缘关系最为接近，聚为一类，与禾本科植物节节麦(XP_020153491.1)、黑麦草(AQM55943.1)、短花药野生稻(XP_015691254.1)、日本稻(XP_015633218.1)、糜子(RLN43340.1)、小米(XP_004985718.1)、玉米(NP_001352090.1)等一起聚为一大类.

图5 PAO1蛋白的三维模型

3 讨论

脱镁叶绿酸a氧化酶(PAO)是叶绿素降解过程中的关键酶，位于成熟叶绿体的内膜上，被一种加速细胞死亡基因编码[6].PAO酶降解叶绿素的方式相对灵活，比如PAO酶的活性可被SGR(一种持绿蛋白，senescence-inducible chloroplast stay-green protein)影响而使植物滞绿[14]，在PAO基因缺失时会形成滞绿的突变体[15-16].它的表达与植物的衰老紧密相关，只在果实成熟和叶片衰老的时期才出现活性[17]，PAO的表达水平在受到伤害以及衰老时会上调基因的表达水平[8].PAO有许多同源基因，在蛋白氨基酸的序列和结构方面有比较高的保守特性.唐蕾比较了油菜中的两个PAO基因(BnPa01和BnPa02)的氨基酸序列一致性达到了98%，同时比较了油菜与玉米、大豆、拟南芥、番茄、豇豆中的PAO氨基酸序列的相似性，相似性介于70%～92%[6].本文中姜荷花的PAO1和PAO2氨基酸序列仅相关4个残基，相似性为99.25%.与其他物种中相似性最高的为小果野芭蕉(PAO1与(XM_009399766.2)为84.72%；PAO2与XP_009398041.1为86.83%)，与唐蕾的研究结果一致，都存在Rieske型(Rieske-type)结构域[6]，但本文PAO都存在有pheophorbide a oxygenase 的特征PLN02518超家族保守区，前文未提及此保守区，可能与前文发表较早，检索数据库尚未收录此保守区信息有关.本研究中PAO基因的成功分离，对研究植物叶绿素降解调控的分子机制提供了基础.

图6PAO基因的分子进化分析