氯霉素对铁还原菌/针铁矿异化还原的影响机制

李晓玲 史 柯 林欣雨 董华平

(绍兴文理学院 化学化工学院，浙江 绍兴 312000)

抗生素具有很强的杀菌和抑菌作用，主要用于预防和治疗人和动物经微生物感染引起的疾病，以及用作牲畜生长的食物添加剂[1].由于抗生素在生物体内不易代谢，大部分母体化合物随着人和动物的粪便排到环境中[2-3].通过土壤吸附、雨水冲刷和地表水渗漏等自然过程，使土壤、地下水和沉积物等厌氧环境中抗生素的含量不断累积和暴露，导致抗性基因的大量扩增和传播，严重威胁人类健康和生态平衡[4].目前，环境中抗生素的降解去除主要采用芬顿[5]、光芬顿[6]、UV/H2O2[7]和零价铁氧化还原[8]等方法，通过产生HO·和SO4·等活性组分将抗生素分解成小分子物质.但是，对于抗生素在土壤、地下水和沉积物等厌氧环境中的迁移转化，以及抗生素对微生物的抑菌性能的演变过程方面，目前研究甚少.

地下水、土壤、沉积物等厌氧环境中，存在大量丰富的含铁矿物.这些矿物作为胞外电子受体，接受来自铁还原菌的胞外电子，供铁还原菌呼吸生长，同时矿物表面Fe(III)被异化还原成Fe(II)[9-10].这些Fe(II)离子能够吸附在矿物表面产生矿物结合Fe(II)，也能够与其他元素相互作用产生新的次生矿物，如磁铁矿、菱铁矿等[11].通过矿物结合Fe(II)和新形成的次生矿物的还原作用，能够降解环境中的硝基苯类化合物、氯代烷烃等有机污染物[12-13]，以及转化环境中的Cr(VI)、U(VI)和Se(IV)/(VI)等重金属离子[11].因此，异化铁还原过程参与了地球上含铁矿物及其他重金属的迁移转化，影响了碳、氮、硫、氧等元素的地球化学循环.

研究表明，厌氧环境中共存的腐殖质[14-15]、金属离子[16]以及小分子有机酸[17]等组分，通过电子传递、配合等作用，影响铁还原菌/铁矿物的异化还原过程.然而，抗生素是否对铁还原菌/含铁矿物异化还原过程产生影响，异化铁还原是否同时参与了抗生素的降解过程，亟待我们研究阐明.

为了更好地认识抗生素在异化铁还原体系等厌氧环境中的迁移转化，以及抗生素对异化铁还原体系的影响，本文以环境中广泛存在的针铁矿(Goethite)为模式铁矿物，脱色希瓦氏菌S12为模式铁还原菌，氯霉素(CAP)作为模式抗生素，主要考察氯霉素对S12异化还原针铁矿的影响，以及异化铁还原对氯霉素抑菌作用的影响，采用XRD、SEM-EDS分析氯霉素存在下S12/针铁矿异化还原产生次生矿物的类型，研究S12/针铁矿体系还原降解氯霉素的主要活性组分，从而阐明氯霉素对S12/针铁矿异化还原的作用机制.

1 实验

1.1 材料与试剂

所用试剂均为分析纯，氯霉素和针铁矿购自Sigma，铁还原菌为脱色希瓦氏菌(ShewanelladecolorationisS12)，购自海洋微生物菌种保藏管理中心.氯化钠购自浙江中星化工试剂有限公司；蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉购自生工生物工程(上海)股份有限公司；十二水合磷酸氢二钠、硫酸铵、无水硫酸镁、N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)、磷酸二氢钾、DL-乳酸钠溶液购自Aladdin，所用水均为去离子水.

LB培养基和厌氧培养基配制方法如下：

LB培养基：称量蛋白胨1 g，酵母提取物0.5 g，氯化钠1 g至100 mL去离子水中，搅拌至全部溶解，用1 mol/L NaOH调pH至7.0，平均分装为4份并密封， 高温高压灭菌(121 ℃， 20 min)，冷却至室温，待用.

厌氧培养基：分别称量十二水合磷酸氢二钠2 g，磷酸二氢钾0.5 g，硫酸铵1 g，无水硫酸镁0.2 g，HEPES 2.38 g至950 mL超纯水中，搅拌使全部溶解，用1 mol/L NaOH调pH至7.0，定容至1000 mL.高温高压灭菌(121 ℃，20 min)，冷却至室温，待用.

1.2 微生物培养

在无菌操作台上将S12接种至无菌LB培养基中， 置控温振荡器中(150 rpm， 30 ℃)培养12 h使生长至对数期.将此生长至对数期的S12接种至无菌LB培养基中再次培养12 h后，冷冻离心(6000 rpm，10 min，4 ℃)后弃去上清液，用厌氧培养基洗涤两次，以此厌氧培养基作为空白对照，在紫外分光光度计波长λ=600 nm处调整其光吸收值(OD)为1.5，备用.

1.3 反应条件

以针铁矿+氯霉素作为对照体系，设计了以下三种反应体系：S12+氯霉素、S12/针铁矿、S12/针铁矿+氯霉素.反应总体积为100 mL，包含1 mL微量元素、10 mL乳酸钠(0.2 mol/L)、1 mL维生素溶液、5 mL S12混悬液(OD=1.5，对照体系不加)、针铁矿为0.2 g (S12/氯霉素体系不加)、 5 mL不同浓度的氯霉素溶液(2 ppm、 5 ppm、10 ppm、20 ppm，S12+针铁矿体系不加)以及厌氧培养基.具体操作如下：在一系列250 mL玻璃瓶中分别加入针铁矿、微量元素、乳酸钠(0.2 mol/L)以及厌氧培养基，密封，高温高压灭菌(121 ℃，20 min)，冷却至室温，使用高纯氮气除氧30 min，此过程中分别加入维生素溶液、S12混悬液(OD=1.5)及不同浓度的氯霉素溶液，密封后放置于控温振荡器中(200 rpm，25 ℃)反应，并定期取样进行测定.

1.4 分析方法

S12生物量的检测按以下方法进行：将0.1 mL反应样品取出后逐级稀释，将稀释后的样品涂布在LB平板上，24 h后计数平板上的菌落个数.邻菲罗啉分光光度法测定反应过程中产生的游离Fe(II)和总Fe(II)，其中总Fe(II)测定方法如下[18]：定期取反应混悬液于10 mL离心管中，与1M无氧盐酸1∶1(V/V)避光浸泡12 h. 随后在一系列10 mL比色管中依次加入5 mL醋酸盐缓冲液(pH 5.0)、1 mL上述反应浸泡样、1 mL 0.5%邻菲罗啉，用去离子水定容至10 mL.静置15 min后，用紫外分光光度计(λ=510 nm)测定吸光度.游离Fe(II)测定中取样用微孔滤膜(孔径为0.22 μm)过滤，其滤液与1 M无氧盐酸1∶1(V/V)避光浸泡12 h，其他方法与总Fe(II)测定相同. 采用标准曲线法计算游离Fe(II)和总Fe(II)浓度，两者相减即为矿物结合Fe(II)的浓度.氯霉素的浓度用高效液相色谱仪(HPLC)进行分析测定，所用HPLC的具体参数如下：日本岛津LC-20AT HPLC系统，使用安捷伦Eclipse Plus C18分析柱(4.6×150 mm，5 μm)，紫外检测波长为277 nm，流动相为乙腈∶水=35∶65(V/V)，流速为1 mL·min-1；进样量：20 μL；柱温：30 ℃.本实验条件下测定，CAP的出峰时间为3.2 min.固体样品的表面晶型通过X-射线衍射仪测定，其测定条件为Cu靶，测试电压为40 kV，测试电流为40 mA，扫描角度范围为10～70°(2θ)，扫描步长为0.026°，扫描速度为100 s/step.固体形貌及元素含量采用扫描电镜(SEM, JEM-1011)-能量色散X射线光谱(EDS)测得.

2 结果与讨论

2.1 氯霉素对S12/针铁矿异化还原产生Fe(II)的影响

S12异化还原针铁矿产生Fe(II)的变化曲线如图1所示，由于我们没有检测到溶液中的游离Fe(II)，测得的Fe(II)可以确定为矿物结合Fe(II). 针铁矿+氯霉素反应体系中， 几乎没有Fe(II)的生成， 说明氯霉素本身对针铁矿没有还原作用.S12/针铁矿体系中，Fe(II)的产生量随着反应进行迅速增加， 反应至第10天时，Fe(II)的生成量达到4.5 mmol/L，说明该S12对针铁矿具有很强的还原能力.S12/针铁矿+氯霉素体系中， Fe(II)的产生量大幅降低， 并随着氯霉素的加入浓度从2 ppm逐渐增加至20 ppm，Fe(II)的产生量从0.93 mmol/L明显下降至0.25 mmol/L，说明氯霉素能够显著抑制S12对针铁矿的异化还原，其抑制作用随氯霉素浓度的增加而明显增强.

(a)2 ppm CAP; (b)5 ppm CAP; (c)10 ppm CAP; (d)20 ppm CAP

图1各反应体系产生的Fe(II)浓度变化图

为了弄清楚氯霉素是如何抑制异化铁还原，我们对各反应体系的S12生物量进行了检测，结果如图2所示.在反应初期，各反应体系的生物量都出现了下降，这主要是由于S12作为一种兼性厌氧菌，在有氧环境中的生长代谢比无氧环境要旺盛许多，从有氧环境转移到无氧环境，微生物有一个逐渐适应过程.S12/针铁矿体系中，S12的生物量在反应第5天后迅速回升，随后稳定在2.2×107CFU/mL左右，说明S12能够利用针铁矿作为末端电子受体进行呼吸生长.而在S12+氯霉素体系中，生物量出现了2～5个数量级的下降，随着氯霉素的浓度从2 ppm增加至20 ppm，生物量从1.5×105CFU/mL下降至2.0×102CFU/mL，说明氯霉素对S12具有很强的抑菌作用. S12/针铁矿+氯霉素体系中， S12的生物量也出现了下降， 但下降幅度明显缓和许多(大约1个数量级之内). 当氯霉素的初始加入浓度为20 ppm时，生物量下降至3.1×106CFU/mL左右，约为S12/针铁矿体系中生物量的1/8左右.因此，可以确定氯霉素通过抑菌作用使S12的生物量明显减少，从而抑制了S12/针铁矿的异化还原.然而，仔细比较S12/针铁矿和S12/针铁矿+氯霉素(20 ppm)体系的生物量和Fe(II)产生量，我们发现生物量的下降幅度(8倍左右)远比Fe(II)的下降幅度(20倍)要小许多，说明S12/针铁矿+氯霉素(20 ppm)体系中有部分产生的Fe(II)被消耗利用了.对比S12+氯霉素(20 ppm)和S12/针铁矿+氯霉素(20 ppm)体系的生物量变化，后者的生物量比前者高出4个数量级，说明异化铁还原过程的存在显著减轻了氯霉素对S12的抑菌作用.

2.2 S12/针铁矿异化还原过程中氯霉素的去除

我们考察了S12+氯霉素、S12/针铁矿+氯霉素等体系中氯霉素的去除情况，结果如图3所示.针铁矿+氯霉素作为对照，在该体系中氯霉素几乎没有去除，说明针铁矿对氯霉素没有吸附作用.在S12+氯霉素体系中，不同初始浓度的氯霉素均出现了一定的下降，反应10天后，初始浓度为2 ppm、5 ppm、10 ppm、20 ppm的氯霉素去除率分别为54.1%、40.9%、38%和19.5%，可见随着初始浓度的提高氯霉素的去除率明显下降.该结果说明当氯霉素初始浓度较低时，S12可以利用一部分氯霉素作为胞外电子受体，供其呼吸生长.当初始浓度较高时，氯霉素对S12的抑菌作用比较明显，导致氯霉素去除率急剧下降.在S12/针铁矿+氯霉素体系中，氯霉素的还原去除效果进一步提高， 反应10天后， 初始浓度为2 ppm的氯霉素被完全去除，5 ppm、10 ppm和20 ppm初始浓度的氯霉素也分别去除了87.5%、87.2%和77.2%.该反应体系氯霉素的去除曲线的变化趋势与S12+氯霉素体系也有明显不同， 前3天氯霉素的下降幅度明显趋缓， 第3～6天内氯霉素的去除速率明显加快，随后又趋于平缓.对照图1中Fe(II)的变化趋势，我们可以得出以下结论：S12在反应初期主要以异化还原针铁矿产生矿物结合Fe(II)为主，当该活性Fe(II)浓度达到一定水平后，对氯霉素进行快速还原去除，Fe(II)被氧化成Fe(III)，导致S12/针铁矿+氯霉素体系中Fe(II) 的产生量维持在较低水平.因此，S12异化还原针铁矿产生的矿物结合Fe(II)是氯霉素降解去除的主要活性组分，与S12+氯霉素体系中S12是降解氯霉素的主要组分完全不同.S12/针铁矿+氯霉素体系中的大部分氯霉素被还原降解，使该体系中的S12受到抗生素的抑菌作用明显减轻，所以生物量比S12+氯霉素体系要高出许多.

(a)2 ppm CAP; (b)5 ppm CAP; (c)10 ppm CAP; (d)20 ppm CAP

图2各反应体系微生物生物量变化图

(a)2 ppm CAP; (b)5 ppm CAP; (c)10 ppm CAP; (d)20 ppm CAP

图3各反应体系中氯霉素浓度变化图

2.3 氯霉素对S12/针铁矿异化还原体系中矿物变化的影响

S12/针铁矿、S12/针铁矿+氯霉素体系反应10天后，将固体取出，经冷冻干燥后，样品采用XRD、SEM-EDS分析，以判断反应过程中是否发生了矿物晶型的变化.XRD分析结果如图4所示，S12/针铁矿体系出现了一组新的衍射峰，2θ角分别为11°、13°、18°、19°、21°、27°、29°、33°、34°、36°、38°和45°，这些峰的位置与标准蓝铁矿的衍射峰完全吻合.再经SEM分析，该反应体系出现了层状菱形的新矿物(图5B和5b)，这与针铁矿的针状类型完全不同(图5A和5a). 对该新次生矿物进一步作EDS分析，测得矿物中Fe、O和P等元素的含量分别为51.6%、38.5%和9.9%(图6b和表1)，这三种元素的含量比与蓝铁矿比较相近.根据以上XRD和SEM-EDS分析结果，可以确定针铁矿在S12的作用下发生了晶型变化，产生新的次生矿物蓝铁矿[11].

S12/针铁矿+氯霉素体系中，当氯霉素的浓度为2 ppm时，XRD图上也出现了2θ角为13°、36°和45°的新衍射峰(图4a)，峰的强度比S12/针铁矿体系明显减弱.SEM图上也出现了新的矿物，但没有明显的层状菱形矿物出现(图5C和5c). 对矿物进一步作EDS分析，测得Fe、O和P等元素的含量分别为45.7%、8.4%和45.9%(图6c和表1)，相比S12/针铁矿体系O元素的含量有所上升，P元素的含量有所下降.根据这一结果，可以判断该反应体系出现了微弱的蓝铁矿，其含量明显低于S12/针铁矿体系.对比其他三种S12/针铁矿+氯霉素体系(包括氯霉素浓度为5 ppm、10 ppm和20 ppm)的XRD分析结果(图4b、4c和4d)，图中全部为针铁矿的特征峰，并无其他新的衍射峰出现.SEM图中也没有新的矿物出现，在低倍镜下看到的只是经冷冻干燥后针铁矿的团聚体(图5C、5c、5D、5d、5E和5e).EDS分析也没有P或其他新的元素(表1).根据以上结果，可以确定氯霉素对S12作用下针铁矿向蓝铁矿的转化具有明显的抑制作用，当氯霉素初始浓度较低时，氯霉素基本上都被矿物结合Fe(II)还原降解，抑制能力相对较弱.

表1 各体系反应后固体样品EDS能谱图中各元素质量百分比

3 结论

氯霉素对S12具有明显的抑菌作用，从而在一定程度上抑制了S12对针铁矿的异化还原，阻碍了异化铁还原过程中针铁矿向蓝铁矿的转化.与此同时，S12异化还原针铁矿产生的矿物结合Fe(II)是氯霉素还原降解的主要活性组分，能够将初始浓度为2 ppm的氯霉素完全降解，降解速率和效率比微生物还原要高出许多，极大地缓解了氯霉素对铁还原菌的抑菌作用.通过本研究，我们首次发现了抗生素对铁还原菌/铁矿物异化还原的影响机制，以及异化铁还原产生的活性组分对抗生素的降解作用.

(a)2 ppm CAP; (b)5 ppm CAP; (c)10 ppm CAP; (d)20 ppm CAP

图4各反应体系反应后固体样品的XRD图

(A)(a)Goethite;(B)(b)S12/goethite;(C)(c)S12/goethite+CAP (2 ppm);

图5各反应体系反应后固体样品的SEM图

(a)Goethite;(b)S12/goethite;(c)S12/goethite+CAP (2 ppm);(d)S12/goethite+CAP (5 ppm);

图6各反应体系反应后固体样品的SEM-EDS图