莱茵衣藻响应缺硫的环状RNA的预测与鉴定

候恺玥，娄素琳，曾志勇，胡章立，2，李 辉，2

1) 广东省植物表观遗传学重点实验室，广东省海洋藻类生物工程技术研究中心，深圳大学生命与海洋科学学院，广东深圳 518060 ；2)深圳市海洋藻类生物工程技术研究中心，深圳大学龙华生物产业创新研究院，广东深圳 518060

环状核糖核酸(circular ribonucleic acid, circular RNA或circRNA)是一类无 5′ 帽子结构和3′ poly A 尾，以共价键连接形成闭合环形结构的非编码RNA分子. 环状RNA广泛存在于包括人类在内的真核生物界, 在生命过程中扮演着重要的调控角色[1-2]. 在植物体内，环状RNA参与花发育、果实成熟和逆境响应等过程[3-4]. 在动物研究中, 有相关报道指出环状RNA与肿瘤发生的分子生物学过程密切相关, 能够直接或间接调节肿瘤的发生[5]. 此外, 环状RNA能够竞争性结合microRNA，发挥分子海绵的吸附作用，从而实现对mRNA的调控[6]. 然而，作为一种崭新的转录后调控因子，目前仅对动物与植物细胞中的环状RNA进行了有限研究，单细胞真核生物是否具有该类型的调控仍属未知. 本研究通过组学测序分析，探究单细胞模式真核生物——莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii,C.reinhardtii)是否存在环状RNA. 硫元素作为莱茵衣藻正常生长的必需元素, 参与衣藻包括光合产氢在内的众多代谢调控途径.课题组前期研究发现，缺硫培养后的衣藻microRNA表达谱发生明显的差异性表达[7-8]，本研究拟对正常与缺硫培养的莱茵衣藻组学数据进行对比，以期探究单细胞真核微藻中是否存在环状RNA，并对营养胁迫进行应答.

1 实验材料与方法

1.1 藻株和培养条件

莱茵衣藻藻株CC849购自莱茵衣藻资源中心(https://www.chlamycollection.org/). 将莱茵衣藻CC849在 TAP(Tris-acetate-phosphate)培养基中培养, 培养温度为22 ℃, 光照强度为50 μmol/(m2·s). 将培养的莱茵衣藻置于恒温光照培养箱培养至对数生长期后, 离心收集藻细胞于TAP-S(缺硫TAP)培养基中重悬，TAP-S培养基按照文献[9]报道的进行配制，所有的硫元素用等物质的量的氯元素代替. 缺硫处理24 h, 培养条件不变, 对照组用TAP培养基在同等条件下同时处理, 用于缺硫前后莱茵衣藻总RNA的提取[7-8].

1.2 cDNA文库的构建与环状RNA的鉴定

用 TRIZOL法提取莱茵衣藻总 RNA, 通过核糖核酸酶(ribonuclease, RNase)R消除线性RNA后, 使用SuperScriptⅢ试剂盒进行反转录得到cDNA. 加入特异性引物(根据环状RNA连接位点设计的背靠背引物), 通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR) 扩增得到约 100碱基对(base pair, bp)的条带, 回收并纯化后测序, 所得序列与预测环状RNA序列相匹配即为成功分离得到的环状RNA.

2 结果与分析

2.1 测序结果分析

对莱茵衣藻缺硫处理前后基因组测序得到原始测序序列, 为了保证信息分析质量, 对raw reads进行以下过滤后获得clean reads：① 去除带接头(adapter)的reads；② 去除无法确定碱基信息的比例大于 10%的reads；③ 去除低质量(质量值(sound quality, SQ)≤5 的碱基数占整个 read 的 50% 以上)的 reads. 后续分析都基于 clean reads预测到的218条环状RNA序列.

图1 缺硫前后莱茵衣藻中环状RNA表达量密度分布Fig.1 Distribution of circRNA expression density in TAP and TAP-S cultured C. reinhardtii

2.2 环状RNA表达水平分析

统计各样本中环状RNA的表达量, 并运用每千个碱基的转录每百万映射渎取的转录本数(transcripts per kilobase of exon model per million mapped reads, TPM)进行表达量归一化处理, 结果如图1. 从图1可见，莱茵衣藻在缺硫处理后, 环状RNA表达量提高. 采用微阵列显著性分析(significance analysis of microarrays, SAM)算法对不同组间差异表达结果进行统计学分析，当P<0.05时，认为差异具有显著性．图2为不同组间存在显著性差异表达的上调转录本(5个)和下调转录本(3个)，N为差异倍数．每个比较组合都会得到一个差异环状RNA 集, 将所有差异环状RNA集取并集后得到8条有显著差异的环状RNA. 莱茵衣藻在缺硫处理后, 环状RNA表达量有显著差异. 因此推测, 莱茵衣藻部分环状RNA是响应缺硫胁迫的.

图2 莱茵衣藻缺硫前后环状RNA的表达差异Fig.2 Differential expression of circRNA volcanoes in TAP and TAP-S cultured C. reinhardtii

3 讨 论

目前，已在哺乳动物和植物中发现环状RNA, 诸多报道证明环状RNA在肿瘤发生中发挥着重要的调控作用, 所以一般将环状RNA作为肿瘤诊断标志物, 在疾病预防和诊治领域发挥重要作用. 本研究在莱茵衣藻中首次发现环状RNA的存在, 不仅丰富了人们对环状RNA的认识, 也为揭示环状RNA存在于低等单细胞微藻提供了依据. 此外，本研究确认莱茵衣藻环状 RNA对缺硫胁迫进行响应，下一步将探讨衣藻环状RNA、microRNA以及靶基因之间的相互作用与调控关系，以期深入理解衣藻环状RNA响应缺硫的机制.