FISH技术在PML/RARA融合基因检测中的应用体会

罗秋萍

急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)是急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia, AML)的一种特殊类型(M3)，其临床特点是出血倾向严重，常易并发弥散性血管内凝血及原发性纤溶亢进，早期病死率高，所以APL的早期诊断和及早治疗至关重要。现已明确t(15；17)是APL的特征性染色体异常，并在分子水平上导致PML/RARA融合基因的形成[1]。对APL患者进行PML/RARA融合基因的检测具有重要的临床价值，可为患者的诊断、疗效和预后提供有效帮助。采用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技术对PML/RARA融合基因进行检测，具有成功率高、准确、省时，对检测标本限制低等优点[2]。因此，如何确保FISH的制片质量显得尤为重要。本科室经实践总结经验，对一些操作细节进行了改进，效果显著，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料 收集广州医科大学附属第三医院病理科2017年1月～2018年10月诊断的64例骨髓或外周血标本。

1.2 主要试剂 氯化钾、甲醇、冰乙酸、胃蛋白酶、HCl、无水乙醇、2×SSC溶液、NP-40溶液，探针选用广州安必平医药公司的PML/RARA融合基因检测试剂盒(粤食药监械生产许20111993号)。

1.3 主要仪器 徕卡显微系统(DM4B)，恒温水浴箱，离心机，恒温烤箱，美国雅培StatSpin ThermoBrite自动原位杂交仪。

1.4 染色方法 (1)取骨髓或外周血2～3 mL(肝素钠抗凝)1 000 r/min离心12 min，用巴氏试管吸取中间的白膜层；(2)将吸取的白膜层细胞加入37 ℃水浴箱中提前预热的低渗液中(0.075 mol/L，5 mL)，吹打混匀，于37 ℃水浴箱中低渗8 min；(3)往细胞低渗液中加入2 mL固定液(甲醇 ∶冰乙酸为3 ∶1)，吹打混匀后离心(1 000 r/min，12 min)；(4)去上清，加入5 mL固定液，吹打混匀后离心；(5)重复以上洗涤步骤，直至细胞沉淀呈白色，加入新鲜固定液，于4 ℃冰箱固定过夜；(6)第2天离心后去上清，根据细胞沉淀量加入合适新鲜固定液，吹打混匀后静置1 min，取10 μL细胞悬液分别滴加到3张干净载玻片上；(7)58 ℃恒温烤箱中烤片120 min以上；(8)在相差显微镜下选取细胞密度合适的玻片，并在玻片合适位置划出杂交区域，以方便后续操作；(9)将玻片放入胃蛋白酶工作液中消化4 min[工作液配制：50 mL纯化水中加入500 μL的HCl(1 mol/L)，置于37 ℃恒温水浴箱中预热，使用前加入3 μL 胃蛋白酶浓缩液(20 mg/mL)]；(10)取出玻片，将其放入10%中性福尔马林/PBS固定液中，室温固定4 min；(11)取出玻片置于2×SSC溶液中洗涤5 min；(12)取出玻片置入70%、80%、100%梯度乙醇中脱水各2 min，取出玻片，室温自然干燥；(13)避光环境中，加探针后放入自动原位杂交仪中进行杂交(78 ℃变性2 min，37 ℃杂交10～18 h)；(14)第2天移去盖玻片，置于48 ℃预热的2×SSC溶液中洗涤4 min；(15)取出玻片置于48 ℃预热的NP-40溶液中洗涤4 min；(16)取出玻片置于70%乙醇，脱水3 min，取出玻片，室温自然干燥；(17)室温滴加DAPI复染液，使用荧光显微镜进行观察判读。

1.5 结果判读 荧光显微镜下GSP PML探针显示绿色信号，GSP RARA探针显示红色信号，若细胞显示为2红、2绿分散存在的荧光信号，则判定为阴性；典型阳性信号为1红、1绿、2黄，当出现2个以上或以下红色或绿色信号表示该基因拷贝数增多或丢失。

2 结果

本实验FISH法检测结果显示，64例标本中有57例标本获得高强度清晰的荧光信号(图1)；5例标本因滴片细胞密度过高，细胞堆积在一起，细胞核上、核外杂信号较多，影响判读(图2)；2例标本因未进行胃蛋白酶消化处理，整张玻片出现模糊和云雾状的背景(图3)。

3 讨论

FISH是一项在体外直接观察细胞中特定的核酸技术，原理是利用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸[3]。FISH检测的关键是清晰地观察到荧光杂交信号，但在激发光照射下，标本背景成分(如核蛋白、胞质蛋白、胶原纤维等)均可产生非特异性背景荧光(未洗除的荧光素标记探针也包含在内)，一旦背景荧光过强，则会影响目标荧光信号的判读。因此，FISH检测的关键除了保证杂交成功外，还需减弱背景荧光，增强目标荧光信号，即提高信噪比[4]。作者在实践中发现，细节操作的改进可以提高信噪比，主要有以下几点：(1)确保白细胞收集的质量：有文献报道白细胞的收集是直接离心去上清后加入0.075 mol/L低渗液，低渗后加入固定液反复清洗直至细胞沉淀呈白色[5]。虽然肉眼可见细胞沉淀呈白色状态，但由于带入血液标本中的红细胞，即使红细胞被裂解，但残留的细胞碎片会产生较多的非特异性背景荧光。肝素钠抗凝的骨髓或外周血标本经过离心，由于比重不同，会出现分层现象，上层淡黄色半透明液体为血浆，中间薄薄一层白色物质为白细胞和血小板，下层暗红色不透明的为红细胞。PML/RARA融合基因的检测只需要收集白细胞，所以实验中只吸取中间的白膜层即可，减少红细胞的带入，降低非特异性背景荧光。(2)细胞悬液制备过程的离心速度是关键：多数文献报道制备细胞悬液时离心速度一般为1 500～2 000 r/min[5-6]。本科室总结多年经验发现细胞核在未彻底固定好的情况下，进行高速离心，可能会发生损坏，直接导致荧光杂交信号分散不集中，甚至无法判读，且这种信号分散的情况是不可逆的[7]。所以细胞悬液制备过程中一般会将离心速度设定在1 000 r/min，离心时间相对延长(12 min)。(3)制片质量：取1张干净的载玻片，重悬细胞后取合适悬液滴加到载玻片上，室温晾干后用10×物镜在相差显微镜下观察细胞密度，要求细胞无重叠，且单视野细胞数量在100～200个为宜，如细胞密度不合适，则根据要求重新制片。若细胞重叠较多，影响信号判读，同时容易影响消化效果产生较多信号杂点；若细胞密度过低，计数达不到100个细胞，同样会影响判读。(4)胃蛋白酶消化时间的把握：玻片在进行杂交前一般需要进行胃蛋白酶的消化处理，消化的目的是通过微小组织蛋白降解，可增加细胞的渗透性从而增加探针的穿透力。如果消化不足会使核酸无法充分暴露，而消化过度则会破坏核酸周围的蛋白结构，导致后续步骤中核酸的丢失[8]。骨髓或外周血标本与石蜡组织切片标本的最大区别：前者细胞分散存在，细胞之间没有过多交联。消化处理的酶一般选用胃蛋白酶，并且浓度相对较低，消化时间可按预试验进行调整。一般消化完成的细胞可在未加探针之前，使用荧光显微镜DAPI通道进行观察，以便及时了解消化效果。消化程度适当的细胞核亮度合适、核膜完整、边缘光滑，通过微调感觉到细胞有立体感，核表面有明显的凹凸不平感，视野清晰；如果细胞核亮度灰暗，产生黑洞和孔状，核膜呈锯齿状一般视为消化过度；如果细胞核亮度刺眼，通过微调，细胞立体感不强，细胞视野比较模糊、轮廓不清、表面有云雾状一般视为消化不足[9]。(5)后固定的必要性：细胞片经胃蛋白酶消化后，采用10%中性福尔马林/PBS固定液进行后固定，固定时间4～5 min。后固定的主要目的是防止核酸在消化处理后，在后续的实验步骤中丢失，同时可以使杂交信号更加集中清晰，利于观察判读。如果后固定液的浓度过高或固定时间过长，则有可能会使蛋白重新发生交联，令杂交信号背景升高，不利于信号观察判读[7]。

①②③图1 PML/RARA融合基因:细胞散在分布,红绿信号清晰明显,油镜 图2 PML/RARA融合基因:细胞重叠堆积在一起,细胞核上、核外杂信号较多,油镜 图3 PML/RARA融合基因:整张玻片出现模糊和云雾状的背景,红绿信号强度尚可,油镜

综上所述，在FISH实验中影响荧光信号的因素较多，要制出一张高质量的FISH切片，需要准确把握每一步骤的实验条件，并谨慎操作。