原发性肝细胞癌组织中CYP2J2和EETs的表达及临床意义

徐 强，宋 蒨，周 瑜，徐元丰，巢浩强， 石红建

原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球较为常见且恶性度较高的肿瘤，其病死率仅次于肺癌和胃癌，位居第3位，发病率居第5位[1-2]。由于HCC早期无明显症状，且较早即发生肝内外转移，确诊时大多已是中晚期，治疗效果较差，严重影响患者的生存期[3-5]。环氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids, EETs)是机体花生四烯酸的代谢产物，在促进组织再生和血管生成方面发挥重要作用，有研究显示EETs可促进肿瘤细胞的增殖和肿瘤血管的生成[6]。细胞色素P450表氧化酶2J2(cytochrome P450 arachidonic acid epoxygenase 2J2, CYP2J2)属于P450同工酶家族，是EETs的新型代谢途径，具有调节血管活性和细胞增殖等功能[7]。相关研究结果显示，EETs、CYP2J2与多种肿瘤的发生、发展有关，但在肝癌中的作用未见相关报道[5-7]。本实验将探讨HCC中EETs、CYP2J2的表达及其与临床病理学特征、预后的相关性，旨在为肝癌患者的诊疗及评估预后提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料 收集2013年1月～2016年12月江苏大学附属武进人民医院经病理确诊的86例HCC石蜡包埋组织为研究对象。收集患者的临床病理资料。患者年龄34～65(48.31±8.21)岁。入组标准：(1)临床信息完整；(2)均接受根治性HCC切除术，经病理确诊为HCC；(3)均为初使治疗，术前均未行放、化疗；(4)诊断及分期符合美国癌症联合委员会(AJCC)第7版标准。

1.2 免疫组化 采用免疫组化SP法检测HCC组织中EETs、CYP2J2的表达。具体步骤：将标本用10%的中性福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，放入恒温烤箱烤片。常规脱蜡脱水，PBS冲洗，柠檬酸高压修复，滴加对应一抗EETs(美国CST公司)、CYP2J2(美国Santa Cruz Biotechnol公司)，4 ℃冰箱过夜，PBS冲洗，滴加对应二抗，PBS冲洗，滴加DAB显色，苏木精复染，中性树胶封固。

1.3 结果判定 EETs、CYP2J2蛋白均为细胞核表达。结果判断标准：(1)按阳性细胞所占的比例评分：无阳性细胞为0分，阳性细胞数≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，>76%为4分；(2)按细胞染色程度评分：未着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；将两项得分结果相乘：≥2分为高表达，<2分为低表达。

1.4 随访 患者每3个月随访1次，记录患者生存时间等。随访截至2018年12月。

1.5 统计学分析 采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计数资料比较采用χ2检验。Kaplan-Meier法绘制生存曲线，比较应用Log-rank检验。单因素及多因素分析采用Cox比例风险模型。应用Spearman分析CYP2J2和EETs表达的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC组织中CYP2J2和EETs的表达 86例HCC组织中36例CYP2J2高表达，高表达率为41.86%(36/86)，低表达率为58.14%(50/86)；45例EETs高表达，高表达率为52.33%(45/86)，低表达率为47.67%(41/86)(图1)。

ABCD

图1 A.肝细胞癌中CYP2J2蛋白高表达；B.肝细胞癌中CYP2J2蛋白低表达；C.肝细胞癌中EETs蛋白高表达；D.肝细胞癌中EETs蛋白低表达，SP法

2.2 CYP2J2和EETs表达与HCC临床病理特征的关系 CYP2J2和EETs不同表达状态的患者在TNM分期、分化程度、有无静脉癌栓和淋巴结转移方面，差异有统计学意义(P均<0.05)；CYP2J2和EETs高表达组患者更多见于Ⅲ+Ⅳ期、中+低分化、合并静脉癌栓和淋巴结转移(表1)。

2.3 CYP2J2和EETs表达与HCC患者预后的关系 CYP2J2低表达组患者的2年生存率为52.00%(26/50)，高于CYP2J2高表达组(30.56%，11/36)，差异有统计学意义(χ2=9.282，P=0.002)；EETs低表达组患者的2年生存率为58.54%(24/41)，高于EETs高表达组(26.67%，12/45)，差异有统计学意义(χ2=14.969，P=0.009，图2、3)。

2.4 Cox单因素和多因素分析 单因素分析结果显示：CYP2J2、EETs、肿瘤分化程度、分期、合并淋巴结转移和合并静脉癌栓与肝癌患者预后显著相关(P<0.05)。多因素分析结果显示：CYP2J2、EETs为影响肝癌患者预后的危险因素(P<0.05，表2、3)。

2.5 HCC组织中CYP2J2和EETs表达的相关性 经Spearman等级相关检验发现，CYP2J2和EETs蛋白表达呈正相关(r=0.810，P<0.001，表4)。

3 讨论

HCC是原发性肝癌中最常见的类型，其发病率及病死率呈逐年上升趋势，发病率位居我国癌症发病率的第5位，2018年全球约有78万例新发肝癌患者，半数以上发生于我国[8]。以肝癌切除术为主，以化疗、放疗和靶向治疗为辅的综合治疗，大大改善了肝癌患者的预后，但即使行根治性切除术，HCC术后复发率仍较高[9]。因此，寻找可靠的标志物和行之有效的干预靶点，有助于肝癌的早期发现和治疗，进而改善肝癌患者预后和提高存活率。EETs是花生四烯酸经细胞色素P450代谢生成，在调节炎症、促进血管生成等过程中发挥重要作用，另可通过下调抗凋亡蛋白的表达防止肿瘤细胞凋亡，能明显促进肿瘤的迁移和侵袭。CYP2J2是P450同工酶家族的一员，广泛分布于肝脏、肺脏等内脏器官以及血管内皮细胞中，参与体内多种生理、病理过程，越来越多的研究发现其在食管癌、肺癌等多种肿瘤中高表达，可促进肿瘤细胞的增殖和转移。

相关研究[10-11]显示，EETs及CYP2J2与多种肿瘤的临床病理学特征具有明显的相关性。本组实验结果显示，EETs及CYP2J2与HCC患者临床病理特征显著相关。CYP2J2和EETs不同表达状态的患者在TNM分期、分化程度、有无静脉癌栓和淋巴结转移方面，差异有统计学意义(P均<0.05)；CYP2J2和EETs高表达患者更多见于Ⅲ+Ⅳ期、中+低分化、合并静脉癌栓和淋巴结转移。EETs及CYP2J2高表达患者更多见于肿瘤分期较晚、分化程度更低、且更易合并静脉癌栓和淋巴结转移等，均是影响HCC患者的预后危险因素。EETs及CYP2J2的表达状态与HCC病灶的直径无明显相关性，提示HCC大小可能更多与肿瘤发生、发展的时间有关。相关研究[12]表明，CYP2J2的表达状态与肿瘤患者的生存时间明显相关。本组实验结果显示，CYP2J2低表达患者的生存期比CYP2J2高表达患者的生存期更长。Jiang等[13]的研究结果显示，过表达CYP2J2可通过影响肿瘤直径和肿瘤的生长速度影响肿瘤患者的预后，且经CYP2J2代谢衍生的EETs可通过影响tetraspanin、MMP和E-cadherin等黏附分子的表达促进癌细胞的增殖和迁移。另一项纳入了101例肿瘤患者的研究[14]显示，77%的肿瘤患者中CYP2J2呈高表达，CYP2J2高表达的患者预后较差。

表1 CYP2J2和EETs蛋白表达与肝细胞癌临床病理特征的关系

图2 CYP2J2不同表达组肿瘤患者的生存曲线

图3 EETs不同表达组肿瘤患者的生存曲线

表2 肝细胞癌患者生存时间的单因素Cox回归分析

RR：相对危险度

表3 肝细胞癌患者生存时间的多因素Cox回归分析

RR：相对危险度

表4 肝细胞癌中CYP2J2和EETs蛋白表达的相关性

本组实验结果显示，HCC中EETs低表达组患者的生存期高于EETs高表达组，这与Nithipatikom等[15]观点一致，认为EETs低表达患者的生存时间高于EETs高表达患者。EETs高表达患者的预后更差，其原因可能是EETs通过直接刺激肿瘤细胞生长和抑制肿瘤细胞凋亡，在体内和体外促进肿瘤发生、发展，因此当EETs表达上调，肿瘤细胞增殖能力加强，更易发生淋巴结转移及远处转移，患者的病情发展较快，影响患者的治疗和预后[16]。EETs抑制剂可通过破坏线粒体，激活c-Jun NH2-末端激酶、Caspase-3和胱天蛋白酶-9促进肿瘤细胞凋亡。单因素和多因素回归分析结果显示，EETs、CYP2J2均为影响HCC患者生存时间的危险因素。经相关性分析显示，EETs和CYP2J2的表达具有明显相关性，提示两者在肿瘤的发生、发展过程中共同发挥作用。因此，EETs和CYP2J2均可能成为HCC患者的治疗靶点，通过特异阻断两者的功能，延缓病情的进展，改善HCC患者的预后。另外，对于HCC患者，可通过检测EETs和CYP2J2蛋白的表达状态，对HCC患者的预后进行评估。

综上所述，CYP2J2和EETs表达状态与HCC临床病理特征具有明显相关性；且CYP2J2、EETs为影响HCC患者预后的危险因素。CYP2J2和EETs能为HCC患者的诊疗及预后预测提供参考依据。