围产期李斯特菌感染6例的临床及分子特征

贾忠兰，叶长芸，许丽风，王怡倩

李斯特菌为革兰阳性短杆菌，其中产单核细 胞李斯特菌（Listeri a monocytogenes）和伊氏李斯特菌（Li steria ivanovi i）具有致病性，能够引起人类和动物李斯特菌感染。作为重要的食源性致病菌，产单核细胞李斯特菌在全球范围内得到广泛关注和深入研究。李斯特菌感染的发病率较其他食源性疾病低，但其病死率高[1]。产单核细胞李斯特菌可穿过宿主的肠道屏障、血脑屏障、胎盘屏障，引起血流感染、中枢神经系统感染和局灶感染。该菌的清除依赖于细胞免疫，孕妇由于妊娠期激素水平升高导致细胞免疫水平下降，是主要的易感人群之一[2-3]。孕妇感染李斯特菌可导致流产、早产、胎死宫内等不良后果；通过母婴感染的新生儿可引发血流感染、脑膜炎甚至死亡。国内以李斯特菌感染散发病例报道为主[4-5]，病原菌的分子流行病学特征分析较少。

根据基因序列分型、菌体抗原和鞭毛抗原，产单核细胞李斯特菌可分为4个家系、12个血清型：家系Ⅰ（1/2b、3b、7、4b、4d和4e）、家系Ⅱ（1/2a、3a、1/2c和3c）、家系Ⅲ和Ⅳ（4a和4c）。家系Ⅰ菌株与暴发或者散发的李斯特菌感染具有相关性，家系Ⅱ菌株多从食品或者相关环境中分离，家系Ⅲ和Ⅳ菌株常分离自反刍动物。1/2a、1/2b和4b血清型菌株是引起李斯特菌感染的常见菌型[6]，占临床李斯特菌感染病例分离株的95%以上[7]。另外，李斯特菌感染的致病性与其毒力基因密切相关，具有毒力基因hl y（溶血素）、i nl A（内化素A）、actA（肌动蛋白）、pl c B（磷脂酶C）和prfA（PrfA蛋白）的李斯特菌可通过血脑屏障和胎盘屏障。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例定义围产期李斯特菌感染病例定义为患者在围产期具有产单核细胞李斯特菌感染的临床症状，从患者的临床标本中能够分离到产单核细胞李斯特菌[8]。

1.1.2 菌株来源2012年1月－2017年12月从北京市海淀区妇幼保健院临床标本中分离的菌株，标本类型涉及孕产妇的宫腔拭子、胎盘拭子和羊水，新生儿的咽拭子、皮肤拭子、耳拭子、血液、脑脊液和粪便。

1.2 方法

1.2.1 血清学分型通过多重PCR对菌株进行血清学分类[9]，并采用日本Denka Seiken公司的血清抗体试剂盒按照说明书进行血清型鉴定。

1.2.2 脉冲场凝胶电泳（PFGE）分析按照美国CDC PulseNet的标准操作程序，选用限制性核酸内切酶Asc I和A paI酶对细菌基因组进行酶切，PFGE图像用BioNumerics（Version 5.0）软件进行比对和聚类分析。

1.2.3 多位点序列分型（MLST）参照法国巴斯德研究所的产单核细胞李斯特菌MLST数据库（http://bigsdb.pasteur.fr/listeria/listeria.html）操作流程，对7个管家基因（abcZ、b lgA、cat、dapE、d a t、l d h、l h k A）PCR扩增片段进行测序和序列比对分析，获得菌株的序列型（sequence type，ST）。

1.2.4 毒力基因检测根据参考文献 [7]合成引物，对分离菌株进行6个毒力基因（pl c B、act A、hly、iap、prfA、inlA）的检测。

2 结果

2.1 临床特征

2012年1月－2017年12月本院6例产单核细胞李斯特菌感染病例（孕妇及其胎儿/新生儿定义为1个病例），孕妇年龄28～35岁，孕周为29～39周，2例患妊娠糖尿病，其他4例孕早期孕检正常。孕妇病程为1～3 d，临床表现为发热、腹痛、胎心胎动异常。4例新生儿均为早发型感染（≤7 d），3例新生儿为早产儿，4例出现胃肠炎、血流感染和脑膜炎等感染症状，1例出生后2 d治疗无效死亡；2例胎死宫内。胎盘病理有不同程度的炎症表现，主要表现为绒毛膜板下及绒毛膜炎症、大量中性粒细胞浸润，其表现符合急性胎膜绒毛膜炎。

孕产妇初始经验性抗菌药物治疗选用头孢呋辛等，明确病原菌为产单核细胞李斯特菌后，调整为青霉素、氨苄西林、美罗培南、左氧氟沙星等治疗，6例孕妇产后抗菌药物治疗后预后良好。胎儿/新生儿预后不良，3例胎儿/新生儿死亡，3例新生儿经抗菌药物治疗后痊愈出院。见表1。

2.2 产单核细胞李斯特菌的分子特征分析

6株产单核细胞李斯特菌分为3种血清型，4b型为主（4株）、1/2a型和1/2b型各1株。MLST结果以ST2为主（3株），ST1、ST5和ST91各1株。通过使用A s c I和A p a I酶的PFGE分析，6株产单核细胞李斯特菌分为5种PT型，其中LM2870和LM2872为相同型别。6株分离菌均检测到毒力基因（plcB、actA、hly、iap、prfA、inlA）。见图1。

3 讨论

产单核细胞李斯特菌是一种重要的食源性致病菌，人或动物食用其污染的食品后会引发严重的疾病，受国内外食品安全和公共卫生相关部门的高度重视。文献报道显示，围产期人群发生李斯特菌感染的风险是非围产期人群的18倍，16%～27%李斯特菌感染病例为孕妇[10]。2017年1月－2018年5月，南非发生有报道以来最严重的李斯特菌感染暴发事件，其中42%病例为孕妇及其新生儿[11]。英国围产期李斯特菌感染占总侵袭性李斯特菌感染病例的12%[12]，美国占17%[13]，法国占17.7%[14]，以色列占35%[15]。我国李斯特菌感染多以散发病例报道为主。根据文献综述，1964－2011年李斯特菌感染中围产期病例占52%[16]，2011－2016年占64.4%[17]。孕妇感染产单核细胞李斯特菌后多表现为非特异性流感样症状，孕妇产后预后良好，但其胎儿或新生儿感染后果严重，甚至死亡。本研究报道的病例孕妇临床表现为发热、腹痛和胎心胎动异常等，结束妊娠后经抗菌药物治疗均预后良好。而胎儿/新生儿预后严重不良，2例胎死宫内，1 例感染严重治疗无效死亡，其余3例新生儿均患有不同程度的严重感染，包括肺炎、血流感染、脑膜炎。根据国内外报道，妊娠期感染产单核细胞李斯特菌后进行敏感抗菌药物治疗，可以避免不良预后[18-19]。产单核细胞李斯特菌对头孢菌素天然耐药，文献推荐一线抗生素氨苄西林≥6 g/d，二线抗生素红霉素4 g/ d，静脉滴注，疗程14 d[10]。本研究6例感染孕妇首选抗生素均为头孢菌素类，明确病原后部分改用青霉素、氨苄西林或左氧氟沙星治疗，经治疗预后良好。新生儿治疗首选抗生素为氨苄西林、头孢菌素类和美罗培南，明确病原菌后均改用氨苄西林。除2例胎死宫内外，1例症状严重患儿氨苄西林治疗2 d后死亡，另外3例新生儿经过治疗痊愈出院。胎儿/新生儿感染的预后严重不良，本组6例中3例胎儿/新生儿死亡。孕晚期或者足月感染的患者根据临床情况进行剖宫产，及时正确的抗菌药物治疗可以减轻新生儿出生后的感染症状，降低新生儿的死亡率。因此，对孕妇进行李斯特菌感染早期诊断和及时治疗，对围产期李斯特菌感染的控制非常重要。

表1 6例围产期李斯特菌感染母婴的临床特征Table 1 Characteristics of 6 cases of maternal-neonatal listeriosis

表1（续）Table 1（continued）

图1 6株产单核细胞李斯特菌临床分离株的PFGE 聚类图Figure 1 PFGE cluster for 6 strains of Listeria monocytogenes isolated from patients

李斯特菌感染主要通过食用被致病菌污染的食品引发，加强食源性李斯特菌感染的流行病学监测非常重要。血清学分型和分子分型是细菌性传染病分子流行病学调查和监测的重要手段，对李斯特菌感染的追踪溯源及预防控制具有非常重要的意义。经过血清学分型，6例感染病例中4例为4b型菌株感染，相关病例胎儿/新生儿预后严重不良，其他2例为1/2a、1/2b型。根据Elinav等[15]和Girard等[20]报道，妊娠相关李斯特菌感染中4b型菌株感染分别占61%和79.5%。脑膜炎患儿的4b型菌株分离率和感染患者的病死率显著高于其他血清型[21]。这些结果表明4b型菌株可能具有较强的毒力，易引起严重的不良预后。国内文献报道人源产单核细胞李斯特菌血清型主要为1/2b、1/2a、4b型，但是血清型1/2b、1/2a占比较高[22-23]，与本研究以4b型为主存在差异，可能与本研究所涉及的患病人群不同有关，还可能与本研究病例数较少有关。根据MLST，6株产单核细胞李斯特菌归为4个ST型，以ST2为主（3株），文献报道CC1（ST1）和CC2（ST2）克隆群属于临床菌株的优势克隆群[24]，且ST2、ST5和ST91菌株与胎盘感染相关[25]，本研究胎盘感染以ST2菌株为主，与文献报道一致。本研究中共有5种PT型，其中病例2和病例4分离的菌株具有相同PT型（PT366），发病时间分别为2012年2月和2013年10月，没有明显时间聚集性，是否为相同感染来源需结合流行病学调查和当地同期食品菌株数据进一步分析。

我国自2000年起开展食品的产单核细胞李斯特菌监测，食品污染率可高达30%[26]。孕妇对李斯特菌感染的整体知晓率较低[27-28]。问卷调查发现80%的孕妇在怀孕期间食用过高风险食物，因此安全饮食对孕妇非常重要[12]。作为易感人群，孕妇在妊娠期间应避免食用易被污染的高风险食品，同时也需加强食品卫生监管。法国通过加强食品安全监管和孕妇饮食安全的宣教，从1984—2011年妊娠期李斯特菌感染的发病数大幅下降[20]。因此对于高危人群应加强李斯特菌感染相关知识的宣传，提高孕妇在妊娠期间安全饮食的意识，减少围产期李斯特菌感染的发生，从而降低新生儿感染率和死亡率。