鸡源益生菌对肠道病原菌的体外拮抗作用

刘欢欢 刘珍珠 王玉荣

摘要：为探究鸡源益生菌对鸡肠道病原菌的影响，从健康的土鸡肠道内分离并鉴定出6株乳酸菌（Lactobacillus plantarum）和1株丁酸梭菌（Clostridium butyricum）。以从腹泻病鸡肠道内分离并鉴定的3株病原菌——大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella enterica）和志贺氏菌（Shigella sonnei）为指示菌，采用平板抑菌法挑选出1株抑菌活性强的乳酸菌;将这株乳酸菌和丁酸梭菌用比浊法测定48 h内的生长曲线和pH值变化曲线;采用体外模拟肠道的方式，将2株益生菌分别与3株致病菌做体外拮抗试验。结果显示，乳酸菌R5和R6的抑菌能力最强，选取R5与丁酸梭菌D2研究其体外对致病菌的拮抗性能。体外拮抗研究表明，在72 h内乳酸菌R5可将病原菌完全杀灭，而丁酸梭菌对3种致病菌也均有显著抑菌作用。发现乳酸菌和丁酸梭菌在体外拮抗作用中均有显著的抑菌作用，而乳酸菌R5的抑菌效果更好。本研究结果可为益生菌的应用提供理论依据。

關键词：益生菌;乳酸菌;丁酸梭菌;拮抗;肠道致病菌;共培养

中图分类号： S182  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）06-0151-05

在禽类养殖行业中，抗生素一直是一种常用的饲料添加剂以防治禽类肠道疾病和促进生长，然而随着抗生素的泛滥使用，也带来了药物残留、病原微生物耐药性增强和养殖环境恶化等负面影响[1]。益生菌以其成本低廉、效果好、绿色无害而备受青睐，可以减少抗生素施用甚至完全替代抗生素[2]。

乳酸菌和丁酸梭菌是广泛应用于禽类的益生菌，它们能够通过多种机制对肠道屏障进行调节以抑制病原微生物在肠道内定植和生长，有的还可以通过分泌抗菌物质杀灭有害微生物，因此对细菌引起的腹泻等疾病能起到良好的预防和治疗作用[3]。

本研究通过从无抗生素喂养的健康土鸡肠道中分离出乳酸菌和丁酸梭菌，以从腹泻病鸡中分离的致病菌为指示菌，筛选出作用较强的益生菌，并研究体外共培养中对致病菌的杀灭作用，为益生菌的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源 益生菌分离自乌鲁木齐南山某个体养殖户无抗生素喂养的健康土鸡;致病菌分离自某养殖场腹泻的病鸡。

1.1.2 培养基 病原菌增菌培养基：NB和NA（固体）;乳酸菌分离培养基：MRS琼脂（添加0.75% CaCO3）;乳酸菌增菌培养基：MRS肉汤;梭菌选择培养基：TSN琼脂;强化梭菌液体培养基：RCM培养基;大肠杆菌鉴别培养基：EMB琼脂;沙门氏菌与志贺氏菌鉴别培养基：SS琼脂;均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

1.1.3 主要仪器设备 单人双面净化工作台（SW-CJ-1F）;恒温培养振荡器（ZWY-2102C）;电热恒温培养箱（SPX-250BF2）;立式压力蒸汽灭菌器（YXQ-LS-75 SII）;电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9070）。

1.2 方法

1.2.1 菌种分离

1.2.1.1 致病菌的分离 将腹泻病鸡颈静脉放血处死后，用无菌器械进行解剖，截取盲肠，取盲肠内容物1 g，溶于9 mL 0.85%无菌生理盐水，充分振荡混匀后，取上清液1 mL依次稀释至10-6，将10-5、10-6稀释液取100 μL均匀涂布于SS平板和EMB平板，37 ℃培养箱培养16 h，EMB上挑选圆润深紫色且有绿色金属光环的菌落[4]，SS平板挑取带有黑点的透明菌落和透明或半透明的菌落[5]，对菌落划线纯化后，进行生理生化检测和16S rDNA鉴定。

1.2.1.2 乳酸菌的分离 将土鸡颈静脉放血处死后，采用无菌器械对土鸡进行解剖，剪下完整肠道，取盲肠内容物1 g，稀释方法同“1.2.1.1”节，稀释至10-7，取10-6、10-7的稀释液100 μL均匀涂布于含有0.75% CaCO3的MRS平板上，37 ℃厌氧培养24 h，挑选有溶钙圈且形态不一的菌落[6]，划线纯化培养后，进行生理生化检测和16S rDNA鉴定。

1.2.1.3 丁酸梭菌的分离 取健康土鸡肠道的小肠部分肠段，用无菌汤匙，刮取小肠黏液，溶于9 mL 0.85%无菌生理盐水中，振荡混匀后，于80 ℃水浴锅中水浴10 min，以去除非芽孢细菌，稀释方法同“1.2.1.1”节，稀释至10-3，取10-2和10-3稀释液100 μL，均匀涂布于TSN平板[7]，37 ℃厌氧培养至长出菌落，选取疑似丁酸梭菌的菌落，于RCM液体培养基内富集培养，选取产酸产气的菌液进行稀释涂布纯化，并进行生理生化检测及16S rDNA的鉴定。

1.2.2 平板打孔法抑菌试验

1.2.2.1 乳酸菌的抑菌试验 将筛选到的乳酸菌在MRS液体培养基静置培养活化24 h，致病菌在普通液体培养基（NB）摇床培养16 h，取灭菌后的营养琼脂（NA）培养基冷却至46 ℃左右，接入1%的致病菌，混匀后，无菌超净工作台下倒平板，待平板冷却凝固后，用打孔器打孔，每个孔内添加100 μL的乳酸菌菌液，常温下静置3 h后，置于37 ℃培养箱，过夜培养。测量每种乳酸菌的抑菌圈，选择抑菌圈效果最明显的菌株，用于后续共培养试验。

1.2.2.2 丁酸梭菌的抑菌试验 将筛选到的丁酸梭菌接入RCM液体培养基，液体培养基加满至锥形瓶瓶口2～3 cm处，采用无菌石蜡-凡士林封口，静置培养活化24 h，抑菌实验方法同上。

1.2.2.3 数据统计 采用IBM SPSS Statistics 22软件分析，采用“x±s”表示。

1.2.3 乳酸菌与丁酸梭菌生长性能和pH值的测定 将抑菌效果较好的乳酸菌与丁酸梭菌活化 24 h，分别接种于装有10 mL MRS液体培养基和 10 mL RCM液体培养基试管各54支，RCM培养基接种完丁酸梭菌后，用灭菌的石蜡-凡士林封口，37 ℃ 静置培养，分别于0.0、0.5、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0、14.0、16.0、18.0、20.0、22.0、24.0、28.0、36.0、48.0 h时各取出3支，测定pH值和D600 nm值，采用Excel 2007软件绘制生长曲线和pH值曲线。

1.2.4 益生菌与致病菌的共培养试验

1.2.4.1 乳酸菌与致病菌的共培养试验 将乳酸菌和致病菌活菌数目稀释至同一数量级后，取装有9 mL MRS液体培养基的无菌试管，以1/10接种量接入致病菌作为对照;另取装有8 mL MRS液体培养基的无菌试管，其中3支以1 ∶ 1比例接入乳酸菌与致病菌各1 mL，每组3个重复，静置培养，每隔 24 h 取出致病菌纯培养液，和致病菌与乳酸菌混合培养液，并用SS与EMB平板计数，计算每支试管内致病菌的活菌数。

1.2.4.2 丁酸梭菌与致病菌的共培养试验 丁酸梭菌与致病菌共培养的方法同“1.2.4.1”节。

1.2.4.3 数据统计 采用IBM SPSS Statistics 22软件分析，并使用Excel 2007作图。

2 结果与分析

2.1 菌种分离鉴定

从健康土鸡中分离出6株乳酸菌和1株丁酸梭菌，从腹泻病鸡肠道内分离出3株致病菌。经过生理生化检测和16S rDNA分子鉴定后，3株致病菌分别为沙门氏菌、大肠杆菌和志贺氏菌;6株乳酸菌包括2株植物乳杆菌，1株粪肠球菌，1株乳酸片球菌，1株海氏肠球菌及1株肠膜明串球菌。16S rDNA鉴定结果及系统进化树见表1和图1。

2.2 平板抑菌试验

6株乳酸菌和1株丁酸梭菌对大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌的抑菌效果见表2。由表2可知，除R9菌株在大肠杆菌和沙门氏菌平板上无抑菌圈外，6株乳酸菌对3种致病菌均不同程度的抑菌效果;其中，R5和R6对3种致病菌的抑菌效果最好，具有显著性差异（P<0.05）。而丁酸梭菌D2对3种致病菌的抑菌效果最弱，没有明显的抑菌圈。

R9在大肠杆菌和沙门氏菌平板上没有抑菌圈，但是对志贺氏菌却有微弱的抑菌效果;R2菌株对3种致病菌都有抑菌能力，但是抑菌效果显著弱于R3和R4（P<0.05）;R3和R4之间的抑菌效果没有明显差异（P>0.05），它们对大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌的抑菌效果较强;而R5和R6菌株对大肠杆菌和志贺氏菌的抑菌能力最强，具有显著性差异（P<0.05），其中R5的抑菌圈直径最大，分别达到8.33 mm和9.67 mm。

对于大肠杆菌，抑菌效果最好的菌株为R5和R6，抑菌圈直径分别为8.33 mm和8.00 mm;在沙门氏菌的抑菌试验中，效果明显较强的菌株为R3、R4、R5和R6，抑菌圈直径分别为9.66、10.66、966、9.66 mm;对志贺氏菌抑制作用较强的菌株也是R5和R6，抑菌圈直径分别为9.67、9.00 mm。因此，R5和R6针对3种致病菌的综合效果更强于其他菌株。

R5和R6菌株在培养过程中，因R5生长速率强于R6，因此取R5菌株用于后续共培养试验。

2.3 乳酸菌和丁酸梭菌的生长曲线、pH值曲线

2.3.1 乳酸菌的生长曲线和pH值曲线 乳酸菌R5的生长曲线和pH值曲线见图2。由图2可知，0～2 h为该菌株的迟滞期，菌株的数目和pH值无变化，2 h后进入对数期，菌数目呈直线快速增长，由于菌数增多，产代谢物乳酸也越多，pH值随之迅速下降，当pH值降低至3.8左右时，乳酸菌的生长由于酸抑制而停滞，在16 h后逐渐稳定，到达稳定期。

2.3.2 丁酸梭菌的生长曲线和pH值曲线 丁酸梭菌D2的生长曲线和pH值曲线见图3。由图3可知，前4 h为丁酸梭菌的迟滞期，4 h后进入对数期，菌数快速增长，产生的酸性物质越来越多，pH值快速下降至 4.7～4.8，菌数不再增长，12 h进入稳定期。

2.4 益生菌与致病菌共培养试验

2.4.1 乳酸菌分别与大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌体外共培养试验 乳酸菌R5分别与大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌的共培养体系中，大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌的数量明显下滑，与致病菌纯培养对比极为明显，具有极显著差异（P<0.01）;在 24 h 时，混合体系的致病菌已被乳酸菌R5抑杀了4个数量级;48 h时，大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌浓度已减少至100 CFU/mL左右;直至72 h，各混合体系中致病菌已被完全杀灭。从以上结果可发现，乳酸菌R5分别和大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌 1 ∶ 1 共培养，72 h内可完全杀灭致病菌，体外抑菌作用很强（图4）。

2.4.2 丁酸梭菌分别与大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌体外共培养试验 丁酸梭菌D2与大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌混合共培养时，D2虽然不能对大肠杆菌起到杀灭的作用，却能明显地抑制致病菌的生长速度。D2与大肠杆菌共培养24 h时，纯培养对照组的大肠杆菌与混合体系中的大肠杆菌活菌数相差并不明显，无显著性差异（P>0.05）;培养 48 h 时，2组中的大肠杆菌數已明显相差2个数量级，差异极显著（P<0.01）;在72 h时，共培养体系中的大肠杆菌生长速度滞后于对照组（P<0.01）（图5-a）。丁酸梭菌D2和沙门氏菌混合培养组与沙门氏菌单纯对照组在72 h内生长曲线相比，混合组的沙门氏菌生长明显弱于对照组，2组沙门氏菌活菌数明显相差1个数量级，在24、48 h均具有显著性差异（P<0.05），而共培养72 h后，混合试验组和对照组差异极显著（P<0.01）（图5-b）。D2与志贺氏菌共培养中，志贺氏菌的活菌数在平缓增长，生长趋势明显弱于志贺氏菌纯培养对照组，在24、48、72 h均具有显著性差异（P<0.05）。以上结果表明，丁酸梭菌的体外抑菌效果相比乳酸菌较弱，但对大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌的生长趋势，具有明显的抑制作用。

3 讨论与结论

乳酸菌和丁酸梭菌属于动物肠道内常见的益生菌，它们对于维持动物肠道微生态平衡、促进营养吸收和增强免疫系统能力都发挥着重要的作用。本研究中，从健康土鸡肠道内分离出的乳酸菌和丁酸梭菌对鸡源性致病菌具有显著的抑制作用。

万荣峰等的研究表明，3株乳酸菌分别与大肠杆菌体外共培养，同时接菌时可在96 h内杀灭所有大肠杆菌，提前接入乳酸菌后培养24 h，再接入病原菌，可在72 h内将大肠杆菌完全杀灭[8]。陈丹等分

离的干酪乳杆菌在与禽致病大肠杆菌体外拮抗研究中表明，96 h内可完全杀灭致病菌，而在培养 24 h 前，混合组大肠杆菌的数目与对照组差异并不显著[9]。本研究中，乳酸菌R5菌株与大肠杆菌 1 ∶ 1 同时接入，72 h时可杀灭所有大肠杆菌;混合组大肠杆菌在前24 h就呈现出极显著差异（P<001），R5菌株对禽致病菌沙门氏菌和志贺氏菌的杀灭作用差异同样极显著（P<0.01），这说明本研究中分离的R5菌株在体外拮抗致病菌方面较强，具有进一步研究和应用的价值。

谢树贵等在酒窖底泥中分离出1株丁酸梭菌，对沙门氏菌和大肠杆菌共培养48 h后，均具有显著的抑菌能力[10]，而在本研究中，从肠道中分离的丁酸梭菌对大肠杆菌和沙门氏菌也有显著的抑制作用，但相比于谢树贵等分离的丁酸梭菌，抑菌效果一般，其原因可能是本试验分离出的丁酸梭菌对酸抑制更为敏感。

本研究中，从健康土鸡肠道分离的乳酸菌和丁

酸梭菌对致病菌均有一定的抑菌效果，其中乳酸菌72 h可完全杀灭致病菌，而丁酸梭菌则会通过阻碍致病菌的生长速度，抑制其快速生长，乳酸菌的抑菌效果明显强于丁酸梭菌。

后续研究需探讨乳酸菌R5和D2抑菌作用机制和产酶特性研究。

参考文献：

[1]潘淑勤，韩浩月，Fernando L，等. 抗生素的副作用及抗生素替代物[J]. 国外畜牧学（猪与禽），2018，38（1）：43-45.

[2]邓泽元. 益生菌及其应用研究进展[J]. 乳业科学与技术，2018，41（1）：26-32.

[3]许 珂，魏 萍. 益生菌作用机制的研究进展[J]. 中国微生态 学杂志，2009，21（1）：90-92.

[4]米建华，于 波，王光宝. EMB琼脂中伊红美蓝适宜配比的选择[J]. 微生物学通报，1982，9（5）：233-235.

[5]杨更发，魏兰芬，许 激，等. 沙门氏菌-志贺氏菌培养基的质量研究[J]. 预防医学情报杂志，2000（1）：54-55.

[6]李明珠，李 辉，王 丹. 乳饮品中耐胃酸乳酸菌的分离鉴定与筛选[J]. 中国酿造，2014，33（9）：42-44.

[7]李圣杰，丁 轲，姜芳芳，等. 鸡源高产淀粉酶丁酸梭菌的分离鉴定[J]. 中国畜牧兽医，2015，42（11）：3073-3079.

[8]万荣峰，江善祥. 3株乳酸菌體外拮抗致病性大肠杆菌试验[J]. 畜牧与兽医，2007，39（3）：50-52.

[9]陈 丹，宋振辉，秦定红，等. 一株干酪乳杆菌的分离鉴定及其对禽致病性大肠杆菌的拮抗作用[J]. 畜牧与兽医，2017，49（12）：83-86.

[10]谢树贵，戴 青，赵述淼，等. 酒窖底泥中丁酸梭菌的分离及其特性研究[J]. 微生物学通报，2007，34（6）：1047-1051.史荣华，周 扬，颜彩霞，等. 1例蛋鸡腺病毒感染的诊断及对SPF鸡的致病性[J]. 江苏农业科学，2020，48（6）：156-159.