玉米螟的分子连接性指数模糊聚类分析

赵昕 陈小颖 陈日曌

摘要：玉米螟危害多种作物，对我国玉米产量与质量的影响尤为明显，我国作为农业大国，防治玉米螟至关重要。为进一步研究不同种类玉米螟生长发育历程及习性，以达到更好地防治效果，利用遗传多样性分析和分子连接性指数模糊聚类方法对不同地理位置和不同寄主的玉米螟进行生物进化研究，分析玉米螟基于不同地理位置和不同寄主2种情况是否各自存在生物型分类。结果表明，在不同地理位置上玉米螟存在生物型分类，而在不同寄主上玉米螟不存在生物型分类。这一研究成果为玉米螟的分类研究和玉米螟防治提供了一种有效的方法。

关键词：玉米螟;DNA序列;分子连接性指数;模糊聚类分析;遗传多样性

中图分类号：S435.132   文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）06-0029-07

收稿日期：2019-03-08

玉米螟，别称玉米钻心虫，属鳞翅目螟蛾科，是一种世界性害虫，在我国主要有亚洲玉米螟[Ostrinia furnacalis（Guenée）]和欧洲玉米螟[Ostrinia nubilalis （Hübner）]，其中亚洲玉米螟在我国是优势种[1]。

玉米螟的分布非常广泛，在我国除了西藏和青海等省份未见报道外，其他省份均有发生，其中黄淮平原和北方地区发生最为严重。玉米螟除了分布广泛外，寄主植物的种类也很多，包括玉米、大豆、蔬菜等。相关调查结果显示，每年我国有10多个省份的农作物都受到玉米螟的危害，减产幅度达到17.5%～51.0%。因此，玉米螟虫的防治对于我国农业生产乃至世界农业生产都至关重要[1]。我国目前防治玉米螟的手段主要有化学防治、生物防治、农业防治等方法[2]。这些措施的综合使用对玉米螟的防治虽然具有一定的效果，但还是没有从根本上解决玉米螟的危害问题，大部分玉米螟依然继续危害农作物。为更好地解决这一问题，国内外诸多研究人员把目光放在了对玉米螟的分类研究上，若玉米螟能够得到有效的种内分类，即可更好地研究各个类别玉米螟生长发育习性，从而能够对玉米螟进行针对性的防治，优化防治效果。

由于目前国内外针对玉米螟的种内分类尚无明确标准，因此本研究试图利用模糊聚类方法对玉米螟的CO Ⅰ基因序列进行基于不同地理位置种群和不同寄主种群的遗传多样性和分子连接性指数聚类分析，探究玉米螟在不同地理位置和不同寄主上有无生物型分类。

1 材料与方法

1.1 样本获取

本研究所用样本是通过玉米螟性诱捕器捕获的61个秆野螟属玉米螟昆虫（诱捕器主要为水盆式诱捕器和黏板式诱捕器），其中包括捕自不同寄主和不同地区的57个亚洲秆野螟属玉米螟昆虫和4个欧洲秆野螟属玉米螟昆虫（表1）。图1为玉米螟样本图。

1.2 数据获取

1.2.1 试验器材与试剂 （1）器材主要有研磨机、离心机、DC-800涡旋混合器、水浴锅、PCR仪、DYY-12C型电泳仪，灭菌的1.5 mL离心管和 2 mL 收集、移液器、紫外分光光度仪等。（2）试剂主要有Insect DNA Kit（50） D0926-01 DNA提取试剂盒、PCR引物、Mixture试剂，均购于吉林省库美生物科技有限公司。

本试验操作室为吉林农业大学中药材学院分子实验室。

1.2.2 基因提取 本研究所用数据为玉米螟的DNA序列，因此采用Insect DNA Kit（50） D0926-01 DNA提取试剂盒对玉米螟进行DNA提取。称取单只玉米螟标本装入1.5 mL离心管中，并装入2颗小钢珠，放入液氮中，5 min后取出，将离心管置于研磨机上研磨至标本粉碎，然后在12 000 r/min的离心机中离心 1 min;加入350 μL Buffer CTL和 25 μL OB蛋白酶，涡旋均匀，于60 ℃水浴箱中振荡孵育30 min后，加入5 μL RNaseA混匀，于室温下放置10～15 min，其他步骤参照Insect DNA Kit（50）D0926-01试剂盒说明。

完成操作步骤获取DNA溶液，对溶液进行浓度测定后，进行基因扩增等后续步骤，以获得CO Ⅰ基因序列。

1.2.2 引物设计与PCR扩增 根据所要提取的COI基因片段进行PCR引物设计，上下游引物分别设計为YRS-1：5′-TTATCGCTTAAATCTCAGC-3′，YRS-2：5′-GACCTTCAAGTAGAAATCG-3′[3]。PCR反应体系和反应程序分别见表2和表3。

最后在4 ℃下保存PCR产物。对PCR产物进行电泳分析并在紫外分光光度仪下检测其浓度。图2为部分PCR产物电泳结果。

1.3 玉米螟遗传研究

玉米螟的取食选择具有多样性，目前针对玉米螟寄主植物种类的研究较多，但对于玉米螟是否存在寄主分类的研究少之又少，本研究利用玉米螟COI基因探讨玉米螟基于不同寄主和不同地理位置的分类。

1.3.1 采自不同地理位置的玉米螟种群遗传研究 将玉米螟依据采集的地理位置不同划分为美国、吉林长春、河南商丘、广西南宁、湖北武汉、安徽合肥6个种群，讨论玉米螟是否存在基于不同地理位置的遗传分化。

由表4可知，除河南商丘种群外，其他5个种群内部无显著遗传差异（P>0.1），而河南商丘种群内部存在显著的遗传差异（P<0.01）。然后进一步分析固定指数（Fst）。

由表5可知，各地理位置种群间的Fst均大于025，表明不同地理位置的种群之间存在遗传分化，之后利用聚类分析进一步验证。

因此，以横轴为样本间遗传距离（P），纵轴为碱基转换距离（Ts）和颠换距离（Tv），构造散点图，当序列间分歧逐渐变大，坐标点呈线性分布时，表示序列间替换尚未达到饱和，序列能够进行后续的系统发育分析[3]。

本研究采用统计学中的回归分析检验遗传距离与颠换距离、转换距离是否符合线性关系，使用MATLAB软件编程计算所得CO Ⅰ基因碱基替换拟合结果见图3。

1.4 碱基饱和度检验

利用分子生物学构建系统发育树需要首先对碱基的饱和度进行检验，作为能否进行系统发育分析的判断依据。若分子生物学分析显示，分子数据不能构造系统发育树，那么，统计学中的聚类分析缺乏前提保障，得到的聚类结果在生物学领域没有意义，缺乏说服力。

生物学中的碱基饱和度分析与统计学中的回

归分析一致，即分析碱基间的遗传距离与碱基转换（transition）和颠换（transversion）距离是否构成线性相关关系。其中，遗传距离为多个性状基因型值构成的多维空间的几何距离，是评定物种间遗传差异程度的指标;颠换为异型碱基的置换，颠换距离为序列对之间发生的颠换位点数与序列长度的比值;而转换是同型碱基的置换，转换距离为序列对之间发生的转换位点数与序列长度的比值。其中碱基的类型分为2种，即嘌呤和嘧啶。

由图3、表8可知，遗传距离与碱基转换距离之间呈线性关系（P=0.037 309 063），且拟合程度良好（r2=0.999 450 238），精确度高（标准误差小）。

由上式可以得到61个样本间的相似关系，从而得到模糊相似矩阵。

1.5.4 模糊等价矩阵的构建 由于“1.5.3”节中所求得的矩阵（R）是否具有传递性尚不明确，因此为了分类，需根据（R）构造模糊等价矩阵（R*）。本研究采用平方法构建（R）*。

当k使（R）2k=（R）2k+1时，此时的（R）2k即为所求的模糊等价矩阵R*，即（R）*=（R）2k。

根据求得（R）*后可知，在不同的分类水平（λ）上，所得到的截距阵不同，从而获取的分类情况也不同。图4为模糊聚类分析动态聚类谱系图。

由图4可知，不同的分类水平，有不同的分类数与之对应。当λ=0.998 2时，美国、吉林长春、河南商丘、广西南宁、湖北武汉、安徽合肥6个种群都单独聚在一起，即河南商丘种群包括8、11、24、61、23、30、35、52、27、28、39、49、53、56、60、57、12、44、22、37、46、42、47，美国种群包括1、2、3、4，吉林长春种群包括5、 33、18、32、59、51、17、31、20、29、41、9、58、10、13、21、45、34、7，广西南宁包括19、36、38、54，湖北武汉包括6、48，安徽合肥包括14、40，当λ=0966 6时，样本得到不同的国家分类，分为欧洲和亚洲2个类别，也属于依据不同的地理位置范畴，说明各个不同地理位置种群之间具有种类区别。

2 结论与讨论

对6个不同地理位置种群和4个不同寄主种群进行生物型分类研究，针对不同地理位置种群，遗传多样性分析结果显示，除河南商丘种群外，其他5个种群内部无显著遗传差异现象，河南商丘种群种内存在显著的遗传差异，并且各个种群间的遗传分化水平很大，聚类结果存在同一地理位置的种群均聚在同一分支的分类情况，表明不同地理位置种群存在生物型分类，形成这种现象的原因是不同地理位置的种群由于地理隔离需要适应各自的地理环境和生存环境，经过长时间的物种进化形成基于地理位置的种群差异。针对不同寄主植物种群，遗传多样性分析结果显示，4个不同寄主种群内部也不存在遗传差异现象且种群间遗传分化水平低，说明种群内部基因交流现象频繁，聚类结果中不同寄主的标本交叉存在，没有将相同寄主种群聚为独立分支，表明基于不同寄主的种群不存生物型分类。

参考文献：

[1]崔 丽. 氟苯虫酰胺和NK130102对亚洲玉米螟的分子作用机理研究[D]. 北京：中国农业科学院，2014.

[2]刘明华，黄巧云. 玉米螟综合防治技术[J]. 上海农业科技，2018（6）：134，141.

[3]杨瑞生，王振营，何康来，等. 中国秆野螟属昆蟲线粒体CO Ⅰ基因遗传多样性及其分子系统学研究（鳞翅目：草螟科）[J]. 南京农业大学学报，2011，34（5）：73-80.

[4]单俐经. 分子连接性指数计算软件制作及应用[D]. 上海：华东理工大学，2011.卫纯洁，陶亚军，范方军，等. 利用重测序染色体片段代换系群体定位水稻籽粒长宽比QTL[J]. 江苏农业科学，2020，48（6）：36-40.