杀致倦库蚊幼虫芽孢杆菌的分离与功效研究*

高 元，丁 露，郭青云，谭小敏，谢青华，王子卓，戴小华

(赣南师范大学 生命科学学院，江西 赣州 341000)

致倦库蚊(Culexquinquefasciatus)属于尖音库蚊复合组，是我国南方常见优势蚊种，也是城镇入室吸血骚扰的主要 “家蚊”[1]，它是丝虫病、流行性乙型脑炎、登革热、西尼罗病毒和寨卡病毒等的重要传播媒介[2]，严重危害人类健康.杀灭蚊虫，切断蚊媒疾病的传播途径是防治这些蚊媒疾病的有效途径之一.

目前国内外用于控制蚊虫的主要措施之一是使用化学杀虫剂[3]，但化学杀虫剂的长期使用导致蚊虫抗药性增强、环境污染和生态平衡破坏等问题.因此，人们一直致力于寻找和发展对环境友好、高效安全的生物杀蚊制剂进行媒介蚊虫的综合控制.其中以生物防治为主的综合治理方法逐渐成为蚊虫防治研究工作中的一个活跃领域[4-6].

目前蚊虫生物防治已受到世界各国的重视，已研究的生物防治候选物众多，但是实际可用的却很少，而已生产应用的更少[7].杀蚊微生物资源丰富，在土壤，水体，昆虫中分布广泛，目前主要来源于芽孢杆菌科、假单胞菌科、肠杆菌科、乳杆菌科和微球菌科等细菌类群[8-13].其中芽胞杆菌在自然界的植物、土壤和虫体中广泛分布，在形成芽孢的过程中细菌形成对蚊幼虫具有特异性毒杀作用的各种毒素蛋白，而对其他生物无毒害作用，因而被广泛的应用到蚊虫的生物防治中[10,12].其中研究比较深入的苏云金杆菌以色列亚种(Bacillusthuringiensissubsp.israelensis)对伊蚊和库蚊的毒力较高，按蚊次之，具有较宽的杀蚊谱且不易产生抗性而被广泛用于蚊虫的防治，也是目前国内外主要的蚊幼虫控制生物制剂[9].目前发现苏云金芽胞杆菌的多种亚种或血清型具有杀蚊幼虫活性，如Canadensi亚种、Morrisoni亚种、Darmstadiensis亚种、Thomsonis亚种和Jegathesan亚种等[14-15].同时也发现多种杀蚊幼虫晶体蛋白如Cry2、Cry4A、Cry4B、Cry10A、 Cry11A、Cry11Bb、Cry19A、 Cry19B、Cry20Aa、Cry27A和Cyt等[16]，随着研究的深入，新的杀蚊晶体蛋白不断涌现.

当前，微生物资源收集受到世界各国的重视.本研究通过对土壤中杀蚊微生物资源收集、分离和鉴定，进行系统筛选，获得具有自主知识产权和有开发应用前景的优良菌株，丰富杀蚊微生物菌种资源库.该研究对控制蚊媒传染病爆发具有重要的理论和应用价值，在蚊虫的生物防治方面具有重要意义.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基

LB培养基和ICPM培养基的配置参照文献[11].

1.1.2 供试蚊虫

敏感致倦库蚊品系引自中国科学院武汉病毒研究所袁志明教授课题组，未接触过任何生物杀虫剂，在实验室已稳定饲养10年以上；该蚊虫品系饲养在26-28 ℃和12∶12 h黑暗和光照(light-dark)交替条件下.

1.2 土样采集

选择植被丰富、腐殖质丰富的土壤，清理土壤表层，采集深度3 cm以下的土样约10 g，装入塑封袋，采集点之间间隔20 m左右，对土样分别进行编号.

1.3 菌株分离

采用醋酸钠-抗生素法.取锥形瓶，装10 mL LB液体培养基，加入100 mg/mL的氨苄青霉素10 μL和2 mol/L醋酸钠(NaAc)712.5 μL，放入0.5 g土样；30 ℃，220 rpm/min的摇床培养4 h，取1 mL悬浮液于EP管，80 ℃下水浴8 min，水浴之后立即冰浴10 min，解冻涡旋1 min，10,000 rpm/min离心5 min，弃上清，用1 mL无菌水重悬，10,000 rpm/min离心5 min，弃上清，取200 μL无菌水重悬沉淀，并将悬液涂布于ICPM固体培养基上，30 ℃培养3-4 d.

1.4 生物测定

挑取疑似芽胞杆菌的菌落接入5 mL ICPM液体培养基中，编号后置于30 ℃，220 rpm/min摇床发酵培养72 h.用一次性塑料杯装入100 mL去氯水，转入上述菌株发酵液1 mL，加入20只3～4龄健康的致倦库蚊幼虫，滴加适量饲料，用清水作对照.48 h之后查看生测结果，记录每个菌株对应的蚊幼虫死亡率.将死亡率在50%以上的记为有毒菌株，死亡率在100%的菌株定为高毒株.对高毒株进一步进行生物测定，每次生测设 5-6个浓度，一组空白对照，每个浓度设2个重复.在26±2 ℃室温下处理48 h，检查幼虫死亡率.用SPSS 13.0软件分别计算蚊幼虫对分离菌株发酵液的LC50及LC90[17].

1.5 光学显微镜观察

选取高毒菌株，接种于ICPM平板上培养3-7 d至芽孢晶体释放，在载玻片上滴上无菌水，挑取少许菌在载玻片上涂布，用酒精灯微火固定后滴加染色液(0.133%的考马斯亮蓝，50%的乙酸)，染色2 min，用水清洗至无色，并在Olympus CX23 光学显微镜下观察菌体和晶体形态.

1.6 利用16S rDNA对菌株分类鉴定

用TIANamp Bacteria DNA Kit (DP302-02)细菌基因组DNA提取试剂盒提取分离得到的高毒力菌株基因组的总DNA，利用16S rDNA通用引物27F(5' AGAGTTTGATCMTGGCTC AG 3') 和1492R (5' TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3')及高保真DNA聚合酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase对分离菌株的16S rDNA进行PCR扩增，扩增程序如下：95.0 ℃，3 min；94.0 ℃，1 min，51.0 ℃，1 min，72.0 ℃，1 min 30 s，35个循环；72.0 ℃，10 min.扩增结束后用1.0%琼脂糖凝胶进行检测，切取目标DNA条带，用Omega D2500-02 Gel Extraction Kit琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化后测序.所获序列经序列在NCBI数据库中进行BLAST同源性对比，利用MEGA 7.0软件构建系统发育树，根据亲缘关系对分离菌株进行鉴定.

1.7 杀蚊菌株蛋白的SDS-PAGE分析

将获得的高毒力菌株在ICPM的液体培养基中培养72 h，使菌株的芽孢和晶体释放，取1 mL菌液于EP管中，10,000 rpm/min离心1 min，收集菌体.用无菌去离子水洗涤菌体，加入200 μL的无菌水重悬菌体，加入5x加样缓冲液，充分混匀后在沸水中煮10 min，12,000 rpm/min离心10 min，取上清10 μL点样.在Bio-Rad电泳仪上进行恒流电泳，分离胶的浓度为10%，浓缩胶的浓度为5%，以20 mA的电流至样品进入分离胶后，电流增大为25 mA继续电泳.电泳结束后，取出凝胶置于考马斯亮蓝R250染色液中染色2.5 h，用脱色液脱色1 h，观察结果.

2 实验结果

2.1 杀致倦库蚊幼虫芽胞杆菌的分离

在陡水湖、五指峰、赣南师范大学校园、崇义阳明山和井冈山共采集103份土样，分离获得芽孢杆菌菌株159株，初步鉴定疑似苏云金芽孢杆菌菌株68株，出菌率(苏云金芽孢杆菌占芽孢杆菌总数的比率)为42.77%；其中有毒菌株52株，有毒率(有毒菌株占芽孢杆菌总数的比率)为32.70%，具体数据详见表 1.其中高毒力菌株有6株，陡水湖分离出2株，标号为D7-1、D4-2；赣南师范大学校园土样分离出2株，标号为X11-2、C3-2；阳明山分离出1株，标号为Yang20-1；井冈山分离出1株，标号为1-2.

表1 不同采样点所分离的芽孢杆菌出菌率和有毒株出菌率

2.2 分离芽孢杆菌对致倦库蚊幼虫的毒力

将分离得到的6株高毒力菌株接种于ICPM液体培养基中，在摇床中震荡培养3 d，待芽孢和晶体完全释放，取发酵液对致倦库蚊4龄幼虫进行生物测定，以商品化的杀蚊菌株球形芽胞杆菌C3-41作为阳性对照株.结果见表2.6株分离菌株对致倦库蚊幼虫50%的致死率LC50值在0.69～1.18 μL/mL之间，符合高毒力菌株的特征，都可以作为潜在的杀蚊微生物资源.其中X11-2、 C3-2毒力最高，分别为0.69和0.74 μL/mL，和商品化的杀蚊菌株B.sphaericusC3-41的毒力相当，可以作为潜在的新型杀蚊制剂；Yang20-1、7-1毒力次之，4-2、1-2毒力稍弱.

表2 分离高毒菌株发酵液对致倦库蚊幼虫48 h的毒力

2.3 菌株形态观察

用肉眼观察生长在ICPM固体培养基上的6株高毒力菌株，发现其菌落为乳白色，煎蛋状，菌落边缘粗糙，呈现典型的芽孢杆菌菌落形态.挑取菌落经考马斯亮蓝染色后在油镜下观察所产生的伴胞晶体形态，菌株X11-2的晶体形状以长方形为主，少量为正方形(图1 A)；菌株C3-2的晶体形状为长方形(图1 B)；菌株Yang20-1的晶体形状主要为不规则形，部分圆形(图1 C)；菌株7-1的晶体形状为以圆形为主，少量为长方形(图1 D)；菌株4-2的晶体形状为方形(图1 E)；菌株1-2的晶体形状也为方形(图1 F).

图1 分离杀蚊幼芽孢杆菌在光学显微镜下的芽孢以及伴孢晶体形态A:X11-2; B:C3-2； C: Yang20-1； D:7-1; E:4-2; F:1-2(箭头所指为菌株的伴胞晶体形态)

2.4 分离的对致倦库蚊幼虫高毒力菌株的分子鉴定

提取分离的6株高毒力菌株的基因组，利用16S rDNA通用引物进行PCR扩增，均产生1.5 Kb左右的目的条带，与预期结果一致.测序后的序列用BLAST程序在GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库中进行相似性搜索，从中获取相近的典型菌株的16S rDNA序列，利用Mega7.0软件将获得的序列与相关菌株的相应序列进行同源性分析，并构建系统发育树[18](图2).结果显示，6株菌与苏云金芽胞杆菌亲缘关系最近，序列一致性在98%以上.其中菌株7-1和苏云金芽孢杆菌以色列亚种B.thuringinesisserovarisraelensis(MK002737)聚为一支，同源性达100%；综合所分离各细菌的形态特征，培养特征以及16S rDNA序列分析，将所获得的菌株归为苏云金芽孢杆菌B.thuringinesis.

图2 分离杀蚊芽胞杆菌基于16S rDNA序列的系统亲缘关系分析

图3 高毒力菌株SDS-PAGE检测结果M: 蛋白分子量标准;1:X11-2;2:C3-2;3:Yang20-1;4:7-1;5:4-2;6:1-2(箭头所指为菌株的晶体蛋白主带)

2.5 杀蚊菌株晶体蛋白的SDS-PAGE

将分离到的6株高毒力菌株X11-2、C3-2、Yang20-1、7-1、1-2和4-2进行SDS-PAGE检测，结果发现6株菌株均发现了明显的晶体蛋白条带(图3).菌株X11-2在29 kDa左右有明显的晶体蛋白主带；菌株C3-2在32 kDa和95 kDa左右有明显的晶体蛋白主带；Yang20-1的晶体蛋白在60 kDa左右有晶体蛋白主带；菌株7-1在29 kDa左右有明显的晶体蛋白主带；而4-2和1-2的晶体蛋白主带小于20 kDa.这些结果说明分离所得高毒力杀蚊菌株的杀蚊幼虫活性主要来自菌株芽孢期产生的晶体蛋白.

3 讨论

芽孢杆菌作为优良的生物防治药剂，科学界对它的研究越来越深入，本研究从陡水湖、五指峰、崇义、学校附近、井冈山5个地点采集103份土壤样本，共分离得159株芽孢杆菌，其中苏云金芽孢杆菌有68株，出菌率为42.77%，有毒菌株52株，有毒菌株出菌率32.70%.从出菌率和生物测定的数据来看，发现陡水湖不仅出菌率高，而且高毒力菌株占比也高，推测这可能跟陡水湖生态环境更为原始，人为干扰程度相对较低有关，另外陡水湖地区水面较多，利于蚊虫孳生、菌株和生态环境的协同进化，更有利于筛选得到高毒力菌株.

通过重复生物测定方法，从分离筛选得到的52株有毒菌株中，最终筛选出6株高毒力菌株.通过与已商品化的灭蚊菌株球形芽孢杆菌C3-41对比发现，X11-2，C3-2的毒力与商品化的灭蚊菌株相当，具有一定的发展为新型杀蚊幼剂的潜能，有望通过进一步研究推广应用.对分离得到的6株高毒力菌株进行形态观察，发现其在平板上呈现典型的苏云金芽孢杆菌的菌落特征，在进一步晶体形态观察中，7-1菌株的晶体以圆形和近球形晶体突出，其他5株的晶体都以方形晶体为主.通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对高毒力菌株进行蛋白分析，结果发现在我们所分离的6株高毒力菌株中，菌株X11-2、C3-2和7-1在29 kDa左右有明显的蛋白主带，推测这些菌株可能含有杀蚊毒素Cyt蛋白；C3-2除含Cyt蛋白外，在95 kDa左右还有一条明显的蛋白主带，推测为Cry类蛋白.而菌株4-2和1-2的晶体蛋白主带小于20 kDa，推测可能是一种新的杀蚊毒素蛋白.可见，所分离高毒力菌株的杀蚊活性主要源于晶体蛋白，其蛋白归类还有待于后续的质谱分析和深入研究，以期为开发利用杀蚊幼虫微生物奠定基础，对丰富我国杀蚊菌种资源和发展我国生物杀虫剂的研究和应用具有实际意义.