沉默GDF15基因表达对高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡和氧化应激的影响

郭海燕，邢志华，王丽丽，解菊芬

1)山西医科大学汾阳学院临床系内科学教研室 山西汾阳 032200 2)山西省汾阳医院内分泌科 山西汾阳 032200 3)山西省汾阳医院血液内科 山西汾阳 032200

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的主要微血管并发症，严重威胁患者生命健康。研究[1]显示，高糖可诱导肾小管上皮细胞凋亡和氧化损伤，这也是DN发生发展的机制之一。因此，抑制肾小管上皮细胞凋亡和氧化应激对于治疗DN或延缓DN发展具有重要意义。生长分化因子15(growth differentiation factor 15，GDF15)是一个分泌蛋白，属于转化生长因子β家族成员，参与心脑血管疾病、肿瘤等的发生发展[2-3]。有研究[4]显示，GDF15可能通过上调磷酸化的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B的表达，拮抗过氧化氢(H2O2)诱导的内皮细胞凋亡。姚新丰[5]报道称，GDF15在DN患者血清中表达升高，诊断DN的敏感度为82.2%，特异度为70.2%，可作为诊断DN的生物学指标。但目前，GDF15基因对肾小管上皮细胞凋亡和氧化应激的影响还未知。本研究首先检测了DN患者肾组织中GDF15蛋白表达水平，然后以人肾小管上皮细胞HK-2为研究对象，探讨了沉默GDF15基因表达对高糖诱导的HK-2细胞凋亡和氧化应激的影响，以期为DN的分子靶向治疗提供一定的思路。

1 对象与方法

1.1研究对象选取2017年12月至2018年5月于山西省汾阳医院肾内科住院并行肾活检确诊的16例DN患者为研究对象，其中男5例，女11例，年龄39～67(53.5±5.9)岁。以同期16例手术治疗的肾癌患者的癌旁正常组织为对照，其中男9例，女7例，年龄42～69(56.3±7.5)岁。本研究经医院伦理委员会批准同意，患者自愿签署知情同意书。

1.2细胞和实验试剂人肾小管上皮细胞株HK-2(中国科学院上海细胞库)，胎牛血清(FBS)和低糖DMEM培养基(美国Gibco公司)，四甲基噻唑蓝(MTT)和胰蛋白酶(美国Sigma公司)，Lipofectamine 2000试剂盒(美国Invitrogen公司)，膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)细胞凋亡试剂盒、二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白检测试剂盒和2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)探针(上海碧云天生物技术有限公司)，兔抗人Bcl-2、Bax和GDF15多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，兔抗人Nrf2和血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)多克隆抗体(美国Abcam公司)，GDF15的小干扰RNA及乱序无义阴性序列(上海吉玛制药技术有限公司)，活性氧簇(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3实验方法

1.3.1 细胞培养 复苏HK-2细胞，加入含体积分数10%FBS的DMEM培养基，于2.5 cm2细胞培养瓶中，置于37 ℃、体积分数5 %CO2、97 %湿度的培养箱中培养。每2～3 d更换一次新鲜培养基。当细胞生长融合至80%左右时，吸弃培养基。加入PBS清洗细胞后，加入2.5 g/L胰蛋白酶溶液消化，传代培养。

1.3.2 细胞转染及效果评价 对数生长期的HK-2细胞接种于6孔细胞培养板中，每孔1×105个。当细胞融合至60%时，参照Lipofectamine 2000试剂盒操作说明，分别将GDF15的小干扰RNA(si-GDF15组)及乱序无义阴性序列(si-NC组)转染至HK-2细胞。转染12 h后，更换新鲜培养基，继续培养48 h，收集细胞。Western blot法检测两组细胞中GDF15蛋白水平，评价转染效果。

1.3.3 细胞分组及处理 将HK-2细胞接种于24孔细胞培养板中，每孔1×104个，分为对照组(细胞正常培养48 h)、高糖组(用含25 mmol/L[6]葡萄糖的DMEM培养基作用48 h)、si-GDF15+高糖组和si-NC+高糖组(转染si-GDF15和si-NC的细胞均用含25 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基培养，转染后继续培养48 h)。每组均设9个复孔。

1.3.4 Western blot法检测各组组织和细胞中GDF15蛋白表达 细胞分组和处理同1.3.3。细胞培养结束后，吸弃培养基，胰蛋白酶消化收集细胞。RIPA蛋白裂解液提取组织和各组细胞中总蛋白，BCA法对蛋白进行定量。取适量蛋白，100 ℃煮沸5 min，变性后，每孔30 μg上样行PAGE电泳。电泳后，湿转至聚偏乙烯二氟膜，于50 g/L脱脂牛奶液中封闭2 h。加入GDF15抗体(按1∶600稀释)，4 ℃孵育过夜。洗膜后，加入辣根过氧化酶标记的二抗(按1∶200稀释)，37 ℃孵育1 h。洗膜后，加入ECL，避光显影，凝胶成像系统曝光拍照。以GAPDH为内参，用Image J软件分析蛋白条带灰度值。

1.3.5 流式细胞术检测各组细胞凋亡率 细胞分组和处理同1.3.3。PBS清洗细胞，加入适量2.5 g/L胰蛋白酶消化，收集细胞。取1.0×106个细胞，PBS清洗后，加入400 μL结合缓冲液轻轻吹打；加入10 μL Annexin V-FITC，避光孵育10 min；加入5 μL PI室温孵育5 min；再加入100 μL结合缓冲液，混匀后上流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.3.6 各组细胞内ROS含量检测 细胞分组和处理同1.3.3。细胞培养结束后，按照ROS试剂盒说明书，吸弃培养基，加入按1∶500稀释后的DCFH-DA，37 ℃孵育40 min；用无血清培养基清洗细胞3次，胰蛋白酶消化，PBS清洗。PBS重悬细胞，用多功能酶标仪检测(激发波长488 nm，发射波长525 nm)ROS含量。

1.3.7 各组细胞内MDA、SOD和GSH-Px水平检测细胞分组和处理同1.3.3。细胞培养结束后，用胰蛋白酶消化，PBS清洗、收集。用细胞裂解液裂解细胞，保留上清液，分别参照MDA、SOD和GSH-Px试剂盒说明书检测上清中MDA、SOD和GSH-Px水平。

1.3.8 各组细胞中Bcl-2、Bax、Nrf2和HO-1蛋白表达的Western blot法检测 细胞分组和处理同1.3.3。检测方法同1.3.4。其中Bcl-2抗体按1∶400稀释，Bax抗体按1∶400稀释，Nrf2抗体按1∶600稀释，HO-1抗体按1∶600稀释。

1.4统计学处理采用Excel和PEMS 3.2进行数据分析。应用两独立样本t检验比较正常肾组织和DN患者肾组织中GDF15蛋白表达的差异，应用单因素方差分析和SNK-q检验比较各组细胞凋亡率、各组细胞中GDF15、Bcl-2、Bax、Nrf2和HO-1蛋白表达以及ROS含量、MDA、SOD和GSH-Px水平的差异。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1正常肾组织和DN患者肾组织中GDF15蛋白表达的比较见图1。与正常肾组织(0.45±0.04)比较，DN患者肾组织(0.81±0.07)中GDF15蛋白表达水平升高(t=17.861，P<0.001)。

1：正常肾组织；2：DN患者肾组织

2.2高糖对HK-2细胞GDF15蛋白表达的影响见图2。与对照组(0.43±0.02)比较，高糖组HK-2细胞(0.87±0.05)中GDF15蛋白表达水平升高(t=24.512，P<0.001)。

1：对照组;2：高糖组

2.3GDF15小干扰RNA转染效果验证结果见图3。与si-NC组(0.45±0.05)比较，si-GDF15组(0.19±0.03)HK-2细胞中GDF15蛋白表达水平降低(t=13.377，P<0.001)。

1：si-NC组；2：si-GDF15组

2.4沉默GDF15表达对高糖诱导的HK-2细胞凋亡的影响见图4。高糖组HK-2细胞凋亡率高于对照组(P<0.05)。si-GDF15+高糖组HK-2细胞凋亡率低于si-NC+高糖组(P<0.05)。高糖组与si-NC+高糖组细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.5沉默GDF15表达对高糖诱导的HK-2细胞氧化应激的影响见表1。由表1可知，与对照组比较，高糖组和si-NC+高糖组MDA和ROS水平升高(P<0.05)，SOD和GSH-Px水平降低(P<0.05)。与si-NC+高糖组比较，si-GDF15+高糖组MDA和ROS水平降低(P<0.05)，SOD和GSH-Px水平升高(P<0.05)。高糖组与si-NC+高糖组比较，各检测指标差异无统计学意义(P>0.05)。

1：对照组；2：高糖组；3：si-NC+高糖组；4：si-GDF15+高糖组。*：与对照组比较，P<0.05；#：与si-NC+高糖组比较，P<0.05

图4 沉默GDF15表达对高糖诱导的HK-2细胞凋亡率的影响

表1 各组HK-2细胞中MDA、ROS、SOD和GSH-Px水平的变化(n=9)

*：与对照组比较，P<0.05； #：与si-NC+高糖组比较，P<0.05

2.6沉默GDF15表达对高糖诱导的HK-2细胞凋亡相关蛋白表达的影响见图5和表2。高糖组和si-NC+高糖组HK-2细胞中Bax蛋白水平高于对照组(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平低于对照组(P<0.05)。si-GDF15+高糖组HK-2细胞中Bax蛋白水平低于si-NC+高糖组(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平高于si-NC+高糖组(P<0.05)。高糖组与si-NC+高糖组Bax和Bcl-2蛋白水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1：对照组；2：高糖组；3：si-NC+高糖组；4：si-GDF15+高糖组

图5 沉默GDF15对高糖诱导的HK-2细胞中Bax和Bcl-2蛋白表达影响

*：与对照组比较，P<0.05； #：与si-NC+高糖组比较，P<0.05

2.7沉默GDF15表达对高糖诱导的HK-2细胞Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白表达的影响见图6和表3。高糖组和si-NC+高糖组细胞质Nrf2蛋白水平低于对照组(P<0.05)，HO-1和细胞核Nrf2蛋白水平高于对照组(P<0.05)。si-GDF15+高糖组HO-1和细胞核Nrf2蛋白水平高于si-NC+高糖组(P<0.05)，细胞质Nrf2蛋白水平低于si-NC+高糖组(P<0.05)。高糖组与si-NC+高糖组HO-1和细胞核Nrf2蛋白水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1：对照组；2：高糖组；3：si-NC+高糖组；4：si-GDF15+高糖组

图6 沉默GDF15对高糖诱导的HK-2细胞Nrf2和HO-1蛋白表达的影响

*：与对照组比较，P<0.05； #：与si-NC+高糖组比较，P<0.05

3 讨论

随着人们饮食习惯的改变，糖尿病的发病率呈现增长的趋势，DN作为糖尿病的常见并发症被广泛关注。肾小管上皮细胞是肾脏的固有细胞之一，在葡萄糖、炎性因子、缺氧等因素诱导时会产生氧化应激和凋亡，最终导致肾小管间质纤维化，严重时导致肾功能衰竭[7]。因此，肾小管上皮细胞的凋亡和氧化应激与DN的发生发展密切相关。

GDF15是一种应激反应蛋白，参与调控细胞凋亡[8]。研究[9]显示，GDF15在DN患者血清中的水平明显高于单独糖尿病人群和健康人群，是影响DN的独立危险因素。目前，还未见GDF15影响肾小管上皮细胞凋亡和氧化应激的相关报道。本研究首先检测了DN患者肾组织中GDF15蛋白表达水平，结果显示，GDF15蛋白在DN患者肾组织中呈高表达，提示GDF15可能参与DN的发生发展。进一步使用高糖诱导人肾小管上皮细胞HK-2后，细胞中GDF15蛋白表达水平升高；通过转染GDF15小干扰RNA沉默GDF15表达后，高糖诱导的HK-2细胞凋亡率和Bax蛋白水平明显降低，Bcl-2蛋白水平明显升高，提示沉默GDF15基因表达可能通过调控Bax/Bcl-2蛋白表达抑制高糖诱导的HK-2细胞凋亡。

高糖环境下，肾小球细胞内氧化作用增强，抗氧化与氧化平衡被打破，细胞内产生大量ROS[10]。ROS进一步造成细胞膜脂质过氧化，损伤细胞膜。MDA是脂质过氧化产物之一，可间接反映脂质过氧化水平[11]。SOD是机体内重要的抗氧化酶，可清除氧自由基，保护机体免受氧化损伤。GSH-Px也是一种抗氧化酶，可与SOD协同作用，减少活性氧自由基的产生，防止脂质过氧化及其中间代谢产物对机体的损害，维持体内的氧化和抗氧化平衡[12]。本研究显示，高糖处理后HK-2细胞ROS和MDA水平升高，SOD和GSH-Px水平降低，说明高糖诱导HK-2细胞产生了氧化应激反应。沉默GDF15基因表达后，高糖诱导的HK-2细胞ROS和MDA水平降低，SOD和GSH-Px水平升高，提示沉默GDF15基因可减轻高糖诱导的HK-2细胞内氧化应激反应，保护细胞免受氧化损伤。

Nrf2/HO-1信号通路在细胞氧化应激和凋亡中发挥重要作用，是机体内重要的抗氧化信号通路[13]。正常生理条件下，Nrf2与其抑制蛋白Keap1在细胞质中形成复合物。当受到氧化应激刺激时，Nrf2磷酸化与Keap1发生解离，并转移至细胞核，进而启动HO-1基因的转录，发挥抗氧化作用，保护细胞免受氧化损伤[14]。本研究显示，沉默GDF15基因表达后，高糖诱导的HK-2细胞HO-1和细胞核Nrf2蛋白水平明显升高，细胞质Nrf2蛋白水平明显降低，提示沉默GDF15基因表达可激活Nrf2/HO-1信号通路，减轻高糖诱导的HK-2细胞氧化应激等损伤。

综上所述，高糖可促进人肾小管上皮细胞HK-2中GDF15表达，沉默GDF15基因表达可减少高糖诱导的HK-2细胞凋亡、减轻氧化应激，其可能通过激活Nrf2/HO-1信号通路，保护HK-2细胞免受损伤，为DN的靶向分子治疗提供了新思路。