熊果酸衍生物的合成及体外抗肿瘤活性研究

徐川东，孟艳秋

(沈阳化工大学 制药与生物工程学院，辽宁 沈阳 110142)

恶性肿瘤对人类健康具有极大危害，从天然产物中提取有效成分并对其结构进行修饰改造已成为近年来抗肿瘤领域研究的热点，研究发现熊果酸可作用于肿瘤的不同阶段.熊果酸又叫乌索酸和乌苏酸，是广泛存在于自然界植物中的一种五环三萜类化合物，熊果酸具有抗肿瘤[1]、抗肝炎[2]、抗菌消炎[3]、抗病毒[4]、抗艾滋病[5]、降血糖血脂[6]、抗糖尿病[7]、镇静[8]等活性.研究发现,熊果酸还具有抗致癌、抗突变、抗促癌、诱导F9畸胎瘤细胞分化分裂和抗血管生成的作用，因此极有可能成为低毒高效的新型防癌抗癌药物[9].熊果酸在抗肿瘤上的良好药理活性并没使其成为临床上使用的抗肿瘤药物，主要是因为熊果酸自身结构导致其水溶性较差，生物利用度偏低.所以实验组对熊果酸进行结构改造，期望能改善其缺点，使其能应用于临床研究.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Büchi B-540型熔点测定仪，瑞士Büchi公司；Bruker ARX-600型核磁共振分析仪，瑞士Bruker公司，CDCl3为溶剂，TMS为内标；LCQ型质谱仪，美国Thermo Fisher Scientific-Finnigan.所有试剂均为分析纯或化学纯.

1.2 新型熊果酸衍生物的合成

Dar[10]将熊果酸(UA)进行了结构改造，得到的熊果酸衍生物抗肿瘤活性非常好.实验组以熊果酸为先导化合物，引入与其类似基团，将C-28位羧基成酯，最终合成5种新型熊果酸衍生物，具体合成路线如下：

其中：

Ⅰ1: R1=CH2CH3，Ⅰ2: R1=CH2CH2CH3，

Ⅰ3: R1=CH2CH2CH2CH3，

Ⅰ4: R1=CH2CH2CH2CH2CH3，

Ⅰ5: R1=CH2CH2CH2CH2CH2CH3.

1.2.1 3-氧代-乌苏烷型-12-烯-28-羧酸(UA1)的合成

将UA溶解于二氯甲烷中，在冰水浴下缓慢滴加新配置的琼斯试剂，自然恢复至室温反应2 h,TLC时刻检测反应是否完毕，确定反应结束后滴加适量异丙醇将剩余氧化剂进行淬灭,乙酸乙酯(EA)及饱和食盐水进取，无水硫酸钠进行干燥,最后抽滤得到粗品，柱层析得白色的UA1，产率为80.42 %,m.p.233.3～234.6 ℃.

1.2.2 2-苯亚甲基-3-氧代-乌苏烷型-12-烯-28-羧酸(UA2)的合成

将UA1和苯甲醛加入50 mL茄形瓶中，乙醇为溶剂，KOH为催化剂，在80 ℃下回流8 h，TLC测试反应终点，反应结束.首先取乙酸乙酯以及饱和食盐水进行萃取，再用无水硫酸钠干燥,最后抽滤旋蒸，快速柱层析得棕黄色的UA2，产率为76.32 %,m.p.143.3～145.6 ℃.

1.2.3 2-苯亚甲基-3-氧代-乌苏烷型-12-烯-28-羧酸乙酯(Ⅰ1)的合成

将UA2和溴乙烷置于50 mL茄形瓶中，DMF为溶剂，无水碳酸钾为催化剂，室温反应，TLC测试反应终点，反应结束.使用乙酸乙酯和饱和食盐水进行萃取，再采用无水硫酸钠进行干燥,最后抽滤旋蒸，柱层析得黄色的Ⅰ1，产率为76.41 %,m.p.148.7～150.4 ℃.ESI-MS，m/z:570.4[M+H]+.1H-NMR(CDCl3,400 MHz)，δ:7.62(dd,J=5.2,2.5 Hz,2H,H-Ph),7.49～7.40(m,2H,H-Ph),7.34(d,J=1.6 Hz,1H,H-Ph),7.30(s,1H,Ph-CH),5.23(s,1H,H-12),4.06～3.97(m,2H,COOCH2),2.52(dt,J=13.9,7.2 Hz,1H,H-18),1.25～1.18(m,6H,CH3,CH2CH3),1.09～1.02(m,6H,CH3×2),0.98(s,3H,CH3),0.92(d,J=5.2 Hz,3H,CH3),0.86～0.81(m,3H,CH3),0.80(s,3H,CH3).

1.2.4 2-苯亚甲基-3-氧代-乌苏烷型-12-烯-28-羧酸丙酯(Ⅰ2)的合成

用1.2.3的方法，UA2与溴丙烷反应制得Ⅰ2，产率为80.26 %,m.p.152.5～154.1 ℃.ESI-MS,m/z:584.9[M+H]+.1H-NMR(CDCl3,400 MHz)，δ:7.65(d,J=2.7 Hz,2H,H-Ph),7.42(d,J=1.4 Hz,2H,H-Ph),7.28(d,J=5.7 Hz,1H,H-Ph),7.19(s,1H,Ph-CH),5.20(s,1H,H-12),4.02(d,J=4.7 Hz,2H,COOCH2),2.58～2.52(m,1H,H-18),1.73(m,2H,COOCH2CH2),1.28(d,J=9.9 Hz,3H,CH3),1.24(d,J=3.9 Hz,3H,CH3),1.13(d,J=11.6 Hz,3H,CH3),1.06(s,3H,CH3),1.01(s,3H,CH3),0.99～0.95(m,3H,CH3),0.93(m,3H,CH2CH3),0.87(s,3H,CH3).

1.2.5 2-苯亚甲基-3-氧代-乌苏烷型-12-烯-28-羧酸丁酯(Ⅰ3)的合成

用1.2.3的方法，UA2与1-溴正丁烷反应制得Ⅰ3，产率为73.91 %,m.p.157.2～159.8 ℃.ESI-MS,m/z:598.5[M+H]+.1H-NMR(CDCl3,400 MHz)，δ:7.92(d,J=7.1 Hz,2H,H-Ph),7.76～7.68(m,2H,H-Ph),7.53(d,J=7.0 Hz,1H,H-Ph),7.23(s,1H,Ph-CH),5.16(s,1H,H-12),3.97～3.87(m,2H,COOCH2),2.68(d,J=20.4 Hz,1H,H-18),1.69(dd,J=29.2,10.1 Hz,2H,COOCH2CH2),1.41(d,J=5.6 Hz,2H,COOCH2CH2CH2),1.34～1.28(m,3H,CH3),1.20(dd,J=17.6,6.3 Hz,3H,CH3),1.14～1.03(m,9H,CH3×3),0.95～0.88(m,3H,CH2CH3),0.84(s,3H,CH3),0.76(s,3H,CH3).

1.2.6 2-苯亚甲基-3-氧代-乌苏烷型-12-烯-28-羧酸戊酯(Ⅰ4)的合成

用1.2.3的方法，UA2与1-溴正戊烷反应制得Ⅰ4，产率为76.56 %,m.p.161.1～163.2 ℃.ESI-MS,m/z:612.4[M+H]+.1H-NMR(CDCl3,400 MHz)，δ:7.78～7.50(m,2H,H-Ph),7.52～7.40(m,2H,H-Ph),7.32(d,J=6.2 Hz,1H,H-Ph),7.06(s,1H,Ph-CH),5.26(t,J=3.0 Hz,1H,H-12),4.02～3.90(m,2H,COOCH2),2.64～2.30(m,1H,H-18),1.86～1.62(m,2H,COOCH2CH2),1.35～1.30[m,4H,COOCH2CH2(CH2)2],1.15～1.00(m,3H,CH3),1.12(d,J=5.8 Hz,6H,CH3×2),0.95(s,3H,CH3),0.92～0.85(m,6H,CH3,CH2CH3),0.82～0.73(m,6H,CH3×2).

1.2.7 2-苯亚甲基-3-氧代-乌苏烷型-12-烯-28-羧酸己酯(Ⅰ5)的合成

用1.2.3的方法，UA2与1-溴正己烷反应制得Ⅰ5，产率为79.17 %,m.p.164.1～166.7 ℃.ESI-MS,m/z:626.4[M+H]+.1H-NMR(CDCl3,400 MHz)，δ:7.76～7.70(m,2H,H-Ph),7.50(d,J=4.6 Hz,2H,H-Ph),7.40～7.32(m,1H,H-Ph),7.26(s,1H,Ph-CH),5.30～5.23(m,1H,H-12),4.12(d,J=5.2 Hz,2H,COOCH2),2.66～2.51(m,1H,H-18),1.68～1.56[m,8H,COOCH2(CH2)4],1.48(t,J=8.2 Hz,3H,CH3),1.34(d,J=18.4 Hz,12H,CH3×4),1.15(s,3H,CH3),0.92(s,3H,CH2CH3),0.85(d,J=5.1 Hz,3H,CH3).

2 抗肿瘤活性实验

实验选用的肿瘤细胞是人胃癌细胞SGC-7901以及人肝癌细胞BEL-7402，而VP-16(依托泊苷)在临床主要用于治疗肺癌、胃癌和食管癌，故选择VP-16作为阳性对照药，以MTT法对合成的产物进行体外抗肿瘤活性测试.将生长至对数生长期的两种肿瘤细胞消化并离心，制备成细胞悬液.将两种细胞的细胞密度调节到2×104个/mL.在96孔板中每孔接种180 μL，需要注意，在保证铺板速度的前提下，要使细胞密度更为均匀，如果能做到每个孔内的数量相差无几最好.结束铺板后，将孔板处于特定环境的细胞培养箱中孵育一段时间.配置药物是用培养基作为溶剂，药物质量浓度分别为33 g/L、11 g/L、3.6 g/L、1.2 g/L和0.4 g/L.向孔板中注入药液，不同的孔板中加入不同剂量和质量浓度的药液.加药结束后将其在特定环境中继续培养一定时间.等待培养时间结束，舍弃孔板中的培养基，在每一个孔板中加入配置的特定质量浓度的噻唑蓝溶液，继续进行孵育.等待培养时间结束，舍弃孔板中的噻唑蓝溶液.配置特定浓度的二甲基亚砜，以相同的浓度和特定的剂量加入到每一个孔板中，待结晶甲瓒完全溶解后，将该板放置于酶标仪490 nm处观察其吸光度，并将数据进行记录.实验重复3次，结果取平均值.不同化合物对BEL-7402和SGC-7901细胞的抑制率和IC50见表1.由表1可知：所得产物对BEL-7402以及SGC-7901细胞都具有较好的抑制效果，产物相对于UA的抑制活性有较大提高，所得产物对于SGC-7901和BEL-7402细胞的IC50相当或是略强于VP-16，药理活性较好.

表1 目标化合物对BEL-7402细胞和SGC-7901细胞的抗癌活性

注：*化合物浓度为10 μmol/L,经过48 h处理后的细胞抑制率.

3 结果与讨论

将熊果酸的C-3位羟基氧化成羰基，再将C-2位与苯甲醛进行羟醛缩合，最后将C-28的羧基与溴代烷反应得到5个新型熊果酸衍生物，体外活性测试对BEL-7402和SGC-7901细胞均表现出一定的抑制作用，随着C-28位烷基侧链的长度增长其活性也随之有所增强.改造后，A环羰基与引入基团形成了电子云密度较高的大π键，能与特定肿瘤细胞更好地结合，产生更好的抗肿瘤药理活性.该结论对熊果酸进行进一步的研究及其衍生物结构设计和优化具有一定的参考价值.