松针主要化学成分及抑制抗胃癌细胞增殖活性研究

李启照， 孙维浩

(安徽新华学院 药学院，安徽 合肥 230088)

雪松(Cedrus deodara)是松科雪松属植物的总称，具有活血消肿、祛风活络等功效，其松针部位同时具有抗菌、抗病毒以及抗氧化等功效。本文通过四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法检测，分析雪松松针的化学成分对癌细胞的抑制作用，为雪松的全面开发利用和深入研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究材料

质谱仪5975C-Agilent；超导核磁共振仪Bruker Avdnce-600测定；MPLC制备型为美国WatersACQUIY。 UpLc.H-cldss；HPLC为1260-Agilent ；酶标仪Bio-Lx-800；MP-70型显微熔点仪测定熔点。雪松松针采自中国安徽大别山金寨县山区。

1.2 研究方法

用95%乙醇(4×8 L)五针松松针干燥粉末(约2.5 kg)提取，用旋蒸减压浓缩，加适量水悬浮，用氯仿(3×4 L)、石油醚(3×4 L)、乙酸乙酯(3×4 L)和正丁醇(3×4 L)依次萃取，减压浓缩得到浸膏(石油醚部分)42.05 g、(氯仿部分)39.2 g、(乙酸乙酯部分)85.6 g和(正丁醇部分)187.5 g。

用石油醚-乙酸乙酯 9∶1～5∶5和石油醚-丙酮 8∶2～5∶5，V/V溶剂系统梯度洗脱氯仿部分，纯化用(氯仿-甲醇 1∶1，V/V)Sephadex LH-20凝胶柱，最终得到化合物3 (17.0 mg)、化合物6 (21.7 mg)、化合物8(14.3 mg)。用硅胶柱色谱分离乙酸乙酯部分，得(Fr.1～Fr.6)6个部分。经减压浓缩Fr.2得浸膏为浅黄色，通过石油醚-丙酮 9∶1～5∶5，氯仿-甲醇9∶1～5∶5，V/V反复硅胶柱分离，同时氯仿-甲醇 1∶1，V/V用Sephadex LH-20凝胶柱纯化，得化合物7 (12.7 mg)；Fr.3用减压蒸馏浓缩得浸膏(深棕色)，反复经氯仿-甲醇 9∶1～6∶4，V/V硅胶色谱洗脱，用Sephadex LH-20凝胶柱(甲醇)纯化，得化合物1 (18.0 mg)、化合物5 (17.5 mg)；Fr.5经减压蒸馏浓缩得黑色浸膏，反复氯仿-甲醇 9∶1～6∶4，V/V硅胶色谱，用氯仿-甲醇 1∶1，V/V Sephadex LH-20凝胶柱纯化，得化合物2 (20.5 mg)、化合物4 (18.7 mg)。

2 结果

2.1 结构鉴定

化合物1白色粉末(甲醇)；1H-NMR (CD3OD，500 MHz)δ：4.51 (1H，d，J=7.5 Hz，H-2)，4.00 (1H，m，H-3)，2.92 (1H，dd，J=(16.0，5.5) Hz，H-4a)，2.51 (1H，dd，J=(16.0，7.9) Hz，H-4b)，5.88 (1H，d，J=2.4 Hz，H-8)，6.86 (1H，d，J=2.0 Hz，H-2′)，6.80 (1H，d，J=8.1 Hz，H-5′)，6.75 (1H，dd，J=(8.1，2.0) Hz，H-6′)；13C-NMR (CD3OD，125 MHz)。查阅文献[1-2]，比对以上数据鉴定为儿茶素，数据见表1。

表1 松针主要成分组装后对肿瘤细胞体外增殖抑制率Tab.1 Inhibition rate of tumor cells in vitro after assemble of pine needle main components

化合物2黄色针晶(丙酮)；EI-MS m/z：270 [M]+，241，213，197;1H-NMR (500 MHz，CD3COCD3)δ：13.00 (OH-4′)，6.31 (1H，d，J=2.2 Hz，H-6)，6.44 (1H，d，J=1.9 Hz，H-8)，7.44 (2H，dd，J=(2.2，6.2) Hz，H-2′,6′)，6.91 (2H，dd，J=(2.5，6.7) Hz，H-3′,5′)；13C-NMR (125 MHz，CD3COCD3)δ：155.2 (C-2)，125.2 (C-3)，182.4 (C-4)，164.7 (C-5)，99.8 (C-6)，163.8 (C-7)，93.6 (C-8)，158.3 (C-9)，104.6(C-10)，124.2 (C-1′)，132.1 (C-2′)，117.12(C-3′)，157.3 (C-4′)，114.3 (C-5′)，132.4 (C-6′)。根据文献[3-4]的研究，以上数据与其比对鉴定为染料木黄酮(表1)。

化合物3淡黄色无定形粉末(甲醇)；1H-NMR (CD3OD，500 MHz)δ：4.16 (1H，d，J=4.8 Hz，H-3)，4.26 (1H，d，J=4.6 Hz，H-4)，5.71 (1H，d，J=2.5 Hz，H-6)，6.10 (1H，d，J=2.4 Hz，H-8)，7.30 (1H，d，J=2.0 Hz，H-10)，6.74 (1H，d，J=8.2 Hz，H-13)，7.03 (1H，dd，J=(8.0 ，2.4) Hz，H-14)，4.70 (1H，br s，H-2′)，4.12 (1H，m，H-3′)，2.61 (1H，dd，J=(16.5，8.0) Hz，H-4′ɑ)，2.80 (1H，dd，J=(16.5，5.2) Hz，H-4′β)，6.18 (1H，s，H-6′)，7.09 (1H，d，J=2.1 Hz，H-10′)，6.79 (1H，d，J=8.0 Hz，H-13′)，6.85 (1H，dd，J=8.0，2.4 Hz，H-14′)；13C-NMR (CD3OD，125 MHz)。以上数据与文献[5]对照基本一致(表1)，故鉴定为花青素A-1。

化合物4白色固体(氯仿)；1H-NMR (CDCl3，500 MHz)δ：1.97 (1H，m，H-1a)，1.70 (1H，m，H-1b)，2.38 (1H，dd，J=(13.3，4.8) Hz，H-2a)，2.32 (1H，dd，J=(13.1，7.3) Hz，H-2b)，2.23 (1H，d，J=6.3 Hz，H-4)， 1.75 (1H，m，H-6)，0.87 (3H，s，H-23)，0.76 (3H，s，H-24)，0.88 (3H，s，H-25)，0.99 (3H，s，H-26)，1.00 (3H，s，H-27)，1.14 (3H，s，H-28)，1.03 (3H，s，H-29)，0.97 (3H，s，H-30)；13C-NMR (CDCl3，125 MHz)。查阅相关文献[6]并结合上述数据比对(表1)，鉴定为木栓酮。

化合物5黄色粉末(甲醇)；ESI-MS m/z 457 [M+Na]+，1H-NMR (CD3OD，500 MHz)δ：7.40(1H，s，H-2)，7.37 (1H，s，H-6)，4.25 (1H，m，H-8)，4.19 (1H，m，H-9)，6.73 (1H，s，H-6′)，4.66 (1H，d，J=8.1 HZ，H-7′)，2.64 (1H，m，H-8′)，3.63 (1H，m，H-9′)，3.91 (6H，s，3，5-OCH3)，3.81 (6H，s，3′，5′-OCH3)；13C-NMR (CD3OD，125 MHz)δ：127.3 (C-1)，106.3(C-2)，148.3 (C-3)，143.7 (C-4)，148.0 (C-5)，106.4 (C-6)，201.1 (C-7)，50.3 (C-8)，72.7 (C-9)，132.1 (C-1′)，106.4 (C-2′)，148.5 (C-3′)，137.5 (C-4′)，148.6 (C-5′)，106.4 (C-6′)，86.5 (C-7′)，56.0 (C-8′)，62.2 (C-9′)，58.1 (3，5-OCH3)，55.7 (3′，5′，-OCH3)。参照文献[7]与结合相关数据，鉴定为刺五加酮(表1)。

化合物6白色针晶(氯仿)；EI-MS m/z：414 [M]+(100)，396 (59)，381 (44)，329 (51)；1H-NMR (CDCl3，500 MHz)δ：5.29 (1H，br d，J=5.2 Hz，H-6)，3.46 (1H，m，H-3)，1.02 (3H，s，H-19)，0.91 (3H，d，J=8.2 Hz，H-21)，0.85 (3H，d，J=7.4 Hz，H-27)，0.82 (3H，d，J=7.4 Hz，H-26)，0.81 (3H，t，J=8.1 Hz，H-29)，0.65 (3H，s，H-18)；13C-NMR (CDCl3，125 MHz)。参照文献[8]并比对上述数据，鉴定为β-谷甾醇(表1)。

化合物7白色固体(丙酮)；1H-NMR (CD3OD，500 MHz)δ：7.50 (1H，d，J=2.1 Hz，H-2)，6.79 (1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，7.53 (1H，dd，J=(8.1，1.7) Hz，H-6)，3.81 (3H，s，-OCH3)；13C-NMR (CD3OD，125 MHz)。参照文献[9]，对比相关数据，鉴定为香草酸(表1)。

化合物8白色细针晶(丙酮)；1H-NMR (500 MHz，CD3COCD3)δ：3.23 (1H，d，J=5.3 Hz，3-OH)，3.01 (1H，s，16-OH)，0.75 (2H，m，H-2)，3.06 (1H，dt，J=5.3，11.2 Hz，H-3)， 0.81 (1H，m，H-9)，1.62 (2H，m，H-15)，1.10 (3H，s，H-17)，0.68 (3H，s，H-18)，0.84 (3H，s，H-19)，0.82 (3H，s，H-20)；13C-NMR (125 MHz，CD3COCD3) δ：37.3 (t，C-1)，27.1 (C-2)，78.1(C-3)，38.7 (C-4)，55.3 (C-5)，18.2 (C-6)，39.7 (C-7)，37.1 (C-8)，51.4(C-9)，34.5 (C-10)，24.4(C-11)，37.1 (C-12)，24.1 (C-13)，28.2 (C-14)，57.8 (C-15)，71.1 (C-16)，31.2 (C-17)，28.1 (C-18)，16.2 (C-19)，14.1 (C-20)。参照文献[10]，3,16α-二羟基-对映贝壳杉烷的数据基本一致。

图1 松针抑制肿瘤细胞IC50值比较Fig.1 Comparison of IC50 values of pine for tumor cell inhibition

2.2 松针主要成分抗肿瘤作用研究

松针活性成分随着浓度的增加，抑制率逐步提高，具有明显的体外抑制肿瘤作用。当剂量达到8 μg/mL时，对肺癌细胞A549和胃癌细胞SGC-7901抑制率分别达到90.46%、86.12%，抑制作用较明显(表1)。松针活性成分抑制肺癌细胞A549的效果最强(IC50=2.77 μg/mL)，对胃癌细胞SGC-7901的抑制作用次之(IC50=3.78 μg/mL)，详见图1。

2.3 松针抑制肺癌和胃癌细胞成分研究

由表2可知，抑制肺癌细胞A549和胃癌细胞SGC-7901的主要活性成分为松针黄酮类(木黄酮、刺五加酮、木栓酮)，其中木黄酮和刺五加酮是抑制两种癌细胞增殖的主要活性成分。

表2 松针主要成分抑制肿瘤细胞IC50值Tab.2 IC50 values of main components of pine needles inhibiting tumor cells(μg/mL,

3 讨论

本研究从雪松松针中分离得到儿茶素、染料木黄酮、花青素A-1、木栓酮、刺五加酮、β-谷甾醇、香草酸、3,16α-二羟基-对映贝壳杉烷8种化合物，同时发现松针黄酮类对肺癌细胞A549和胃癌细胞SGC-7901抑制率分别达到90.46%、86.12%，IC50分别为2.77 μg/mL、3.78 μg/mL，其较强的抗肿瘤作用，可能与松针中含有木黄酮、花青素、木栓酮、刺五加酮有关。研究表明，黄酮类化合物可产生活性氧是抗肿瘤的活性基团，可催化谷胱甘肽及辅酶共氧化，提高剂量可以发挥等效作用。松针黄酮抗肿瘤机理主要是影响细胞膜，改变细胞的生理功能，影响细胞代谢；影响自由基与过氧化形成，影响免疫系统的反应性，导致DNA片段凋亡等作用。

研究发现，雪松松针总黄酮对不同肿瘤细胞体外增殖均具有一定增殖抑制作用。在今后研究中应积极开展松针黄酮体内抗肿瘤作用实验研究，以期更深入、更全面地研究其抗胃癌的机理，充分利用雪松松针资源开发新型抗肿瘤药物，为备选化合物提供借鉴和理论支撑。