miR-34a和SIRT1在子痫前期患者胎盘中的表达及意义

周冰皓 邱菊 田艳杰 李秋爽

子痫前期是妊娠期特有的疾病，是指妊娠20周以后，孕妇出现高血压和蛋白尿等症状，并伴有疼痛、恶心、上腹不适症状，可发展为子痫，导致母婴不良结局。子痫前期病因及病理机制较为复杂，涉及多系统紊乱[1]。有研究表明，胎盘灌注不足是引起子痫前期的因素之一，而胎盘灌注不足由滋养层细胞异常凋亡引起[2]。近年来miRNA与滋养细胞凋亡的关系成为子痫前期发病机制的研究热点，有文献表明，miR-34a与细胞凋亡密切相关[3]，但有关miR-34a在子痫前期中研究较少。另有研究表明沉默信息调控子1(silent mating type information regulation 2 homolog 1，SIRT1)与细胞凋亡密切相关，且SIRT1是miR-34a的靶基因[4]，因此本研究主要分析子痫前期患者胎盘组织miR-34a、SIRT1表达情况，探讨二者在子痫前期过程中可能发挥的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年9月至2018年9月住院择日行剖宫产的子痫前期患者63例，根据病情程度分为子痫前期轻度组29例，年龄(31.21±4.33)岁；孕周(28.35±2.47)周。子痫前期重度组34例，年龄(30.91±4.18)岁，孕周(27.61±3.05)周。另选取同期因胎位不正等原因经剖宫产分娩的正常妊娠孕妇31例作为对照组，年龄21～39岁，平均年龄(30.76±3.38)岁，孕周(28.42±2.07)周。3组间孕妇年龄及孕周比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经本院伦理委员会批准通过，所有样品采取得患者及家属知情同意并签字。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：子痫前期纳入标准：符合子痫前期诊断标准[5]；患者及家属选择接受剖宫术分娩；患者均为单胎初次妊娠。

1.2.2 排除标准：辅助生殖技术受孕者；孕前患有高血压者；严重的肾病、慢性高血压、自身免疫病、肝病；妊娠期糖尿病、胎盘早剥等其他产科并发症。

1.3 子痫前期分度标准 按照第八版《妇产科学》规定的诊断标准[5]，(1)轻度：①妊娠20周后孕妇收缩压≥140 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)和(或)舒张压≥90mm Hg；②蛋白尿≥0.3 g/24 h或随机尿蛋白(+)。(2)重度：孕妇血压和尿蛋白持续性上升，出现以下任一条症状者即可诊断为子痫前期重度。①孕妇血压持续上升，收缩压≥160 mm Hg和(或)舒张压≥1 100 mm Hg；②蛋白尿≥5.0 g/24 h或随机尿蛋白(+++)；③肝酶丙氨酸氨基转移酶或天冬氨酸氨基转移酶含量升高，肝功能异常；④尿量<17 ml/h或尿量<400 ml/24 h或血肌酐>106 μmol/L，肾功能异常；⑤贫血、血管内溶血、黄疸或血小板<100×109/L；⑥上腹部持续性疼痛、发生肝包膜下血肿或肝破裂；⑦持续性头痛、视觉发生障碍或其他脑神经损伤症状；⑧羊水过少、胚胎生长受限。

1.4 方法

1.4.1 标本采集:所有研究对象胎盘娩出后10 min内从近脐带附着处切取1 cm×1 cm×0.2 cm胎盘全层组织两块。用预冷的0.9%灭菌氯化钠注射液快速冲洗3次，去除血污，其中1块组织用灭菌滤纸吸去水分，装入1.5的EP管中，放置-80℃冰箱保存备用；另1块组织放入10%中性甲醛中固定24 h，经乙醇梯度脱水，二甲苯透明浸蜡后，石蜡包埋成块备用。

1.4.2 实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantification PCR，qRT-PCR)法检测胎盘组织miR-34a、SIRT1 mRNA相对表达量:采用qRT-PCR法检测研究对象胎盘组织中miR-34a及SIRT1 mRNA相对表达量。按照Trizol试剂盒说明书操作提取组织总RNA，按照miRNA反转录试剂盒操作步骤将2 μg RNA反转录为cDNA，之后按照SYBR Green RCR master mix试剂说明配反应体系并加样。qRT-PCR反应体系共为20 μl：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl，cDNA 2.0 μl，上下游引物各0.8 μl，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μl，ddH2O 6.0 μl。完成后将其放入荧光定量PCR仪上进行反应，程序设定为：95℃ 30 s，60℃ 15 s，72℃ 15 s，共40个循环。miR-34a及SIRT1分别以U6、GAPDH为内参基因，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反应结束后收集数据，并对所得数据Ct值进行分析，采用2-ΔΔCt算法计算miR-34a、SIRT1 mRNA相对表达量。见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4.3 免疫组化法检测胎盘组织中SIRT1蛋白表达情况:取1.2.1中石蜡包埋的胎盘组织切片，以4 μm的厚度切片并采用免疫组化法染色，严格按照试剂盒说明书进行操作，DAB(二氨基联苯氨)显色液进行显色反应，采用苏木素复染并将其在不同梯度乙醇中脱水，中性树脂进行封片，置于显微镜下进行观察。在200倍光镜下观察结果并从每个切片中选取10个高倍视野中随机挑选并对阳性染色细胞数量进行统计。采用半定量积分法判定结果：阳性细胞百分比×染色程度。阳性细胞百分比：<5%记为0分；5%～25%记为1分；26%～50%记为2分；>50%记为3分。染色程度：无色0分；淡黄色1分；棕黄色2分；棕褐色3分。取阳性百分比和染色程度计分之乘积：≤2分为阴性，>2分为阳性。

2 结果

2.1 3组孕妇临床资料比较 与对照组孕妇相比，子痫前期轻度组、重度组收缩压、舒张压、平均脉动压、24 h 蛋白尿升高(P<0.05)；且子痫前期重度组孕妇收缩压、舒张压、平均脉动压、24 h蛋白尿水平高于子痫前期轻度组(P<0.05)。见表2。

项目对照组(n=31)子痫前期轻度组(n=29)子痫前期重度组(n=34)F值P值收缩压(mm Hg)112.18±28.05147.31±36.83*170.39±42.60*#20.749<0.001舒张压(mm Hg)84.15±21.04100.18±25.05*120.27±30.07*#15.988<0.001平均动脉压(mm Hg)102.84±25.71131.60±32.90*153.68±38.42*#19.335<0.00124 h尿蛋白(g/24 h)0.12±0.040.87±0.31*5.35±1.24*#444.63<0.001

注：与对照组比较，*P<0.05；与子痫前期轻度组比较，#P<0.05

2.2 3组孕妇胎盘组织中miR-34a、SIRT1 mRNA表达水平 3组孕妇胎盘组织miR-34a、SIRT1 mRNA水平差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组孕妇相比，子痫前期轻度组、重度组胎盘组织miR-34a表达显著升高(P<0.05)，SIRT1 mRNA表达显著降低(P<0.05)；与子痫前期轻度组孕妇相比，子痫前期重度组胎盘组织miR-34a水平显著升高(P<0.05)，SIRT1 mRNA表达显著降低(P<0.05)。见表3。

组别miR-34aSIRT1 mRNA对照组(n=31) 1.01±0.211.03±0.20子痫前期轻度组(n=29)1.79±0.33*0.64±0.11*子痫前期重度组(n=34)2.18±0.54*#0.35±0.07*#F值74.007201.254P值<0.001<0.001

注：与对照组比较，*P<0.05；与子痫前期轻度组比较，#P<0.05

2.3 3组孕妇胎盘组织中SIRT1蛋白表达 免疫组化结果显示SIRT1位于滋养细胞细胞核内，少量存在于细胞质中。与对照组孕妇比较，子痫前期轻度组、子痫前期重度组SIRT1蛋白阳性表达率降低(P<0.05)；与子痫前期轻度组孕妇比较，子痫前期重度组SIRT1蛋白阳性表达率降低(P<0.05)。见图1，表4。

SIRT1表达阳性 SIRT1表达阴性

图1 胎盘组织中SIRT1蛋白表达(免疫组化×200)

2.4 子痫前期孕妇胎盘组织中miR-34a和SIRT1 mRNA表达相关性 Pearson相关性显示：miR-34a表达与SIRT1 mRNA表达呈负相关(r=-0.874，P<0.05)。见图2。

表4 3组胎盘组织SIRT1蛋白表达情况 例

图2 子痫前期胎盘组织miR-34a和SIRT1 mRNA相关性分析

3 讨论

子痫前期是造成母婴不良结局的产科并发症之一，全球发病率为5%～8%，其发病机制尚未完全阐明。相关研究表明，子痫前期的发生涉及滋养层细胞异常凋亡、血流灌注异常、炎性反应等诸多原因。有研究表明，miR-34a、SIRT1与细胞凋亡密切相关，且SIRT1是miR-34a的靶基因[3,4]，因此本研究主要探讨子痫前期患者胎盘组织中miR-34a、SIRT1表达情况。

目前认为胎盘滋养细胞异常凋亡与子痫前期疾病密切相关，正常情况下，绒毛外滋养细胞以类似恶性肿瘤细胞样的行为侵入到子宫螺旋动脉周围，破坏肌层和弹性组织，并替代血管内皮细胞，诱导子宫螺旋动脉重构，使其管径扩张，胎盘血流灌注增加。而孕早期滋养细胞过度凋亡引起子宫螺旋动脉重塑异常，造成胎盘血流灌注不足，胎盘缺氧、缺血，引发胎盘和内皮组织损伤，在孕20周后导致血压高血压、蛋白尿等母体症状，发生子痫前期[6-8]。近年大量研究表明表明，SIRT1蛋白参与多种类型肿瘤的发生发展，包括子宫内膜癌[9]、卵巢癌[10]、胃癌[11]等。在哺乳动物细胞中，SIRT1可通过减少p53乙酰化抑制细胞凋亡[12]。Li等[13]研究表明，乳腺癌患者癌组织SIRT1表达量显著高于其癌旁组织，提示SIRT1在乳腺癌中发挥促进癌细胞增殖，抑制细胞凋亡的作用。Lee等[14,15]研究表明，SIRT1通过抑制肿瘤细胞凋亡，在肝癌、大肠癌中发挥促癌作用。以上研究提示SIRT1表达与细胞凋亡密切相关。本研究结果显示SIRT1蛋白主要表达于绒毛滋养细胞中，在绒毛间质细胞中有少量表达，分析发现子痫前期孕妇胎盘组织中SIRT1 mRNA表达量、SIRT1蛋白阳性表达率显著低于正常孕妇，且重度组低于轻度组，表明SIRT1低表达可能与子痫前期发生有关，且与子痫前期病情严重程度有关。推测SIRT1表达下调，可能通过加速滋养层细胞凋亡，致使胎盘血流灌注不足，胎盘缺氧、缺血，引发胎盘和内皮组织损伤，参与子痫前期疾病发生。

miRNAs是一类内源性非编码小RNA分子，通过与靶mRNA的3’端非编码区结合抑制转录。miR-34a位于1号染色体的3区6带，有两个外显子。miR-34a通过靶向HMGB1促进视网膜母细胞瘤细胞凋亡[16]。Yang等[17]研究表明，miR-34a在诱导胃癌癌细胞凋亡。本研究通过qRT-PCR技术检测表明，子痫前期孕妇胎盘组织miR-34a表达量显著高于正常孕妇，且随子痫前期病情加重表达量升高，提示miR-34a与子痫前期的发病密切相关。Yan等[18]研究表明，SIRT1是miR-34a的靶基因，miR-34a通过下调SIRT1表达促进软骨细胞凋亡进程。Pearson法分析显示，子痫前期孕妇胎盘组织中miR-34a与SIRT1 mRNA水平呈负相关，猜测在子痫前期患者中，miR-34a可能通过调控SIRT1表达参与胎盘滋养层细胞凋亡进程，影响子痫前期疾病发生。此外另有研究表明miR-34a可通过通过抑制DLL1的表达抑制胎盘血管生成。因此推测miR-34a可能通过调节不同靶基因表达，共同参与子痫前期发生发展过程，相关机制有待进一步研究。

综上所述，子痫前期孕妇胎盘组织中miR-34a高表达，SIRT1蛋白低表达，miR-34a可能通过负调控SIRT1蛋白参与子痫前期过程。本研究也存在一定不足，相关机制有待进一步研究。