Bim与EGFR敏感突变肺腺癌患者经吉非替尼一线治疗后获得性耐药的相关性分析

高俊珍 刘艳芳 王立红 付秀华 徐磊 顾岩

随着人们生活方式的不断改变以及生活环境的逐渐恶化，肺癌的发病率及病死率正呈逐年升高趋势，且在所有恶性肿瘤中位居首位，严重威胁人类的生命健康安全[1]。本世纪初表皮生长因子受体(EGFR)首次被发现，并在2008年被证实EGFR突变属于肺腺癌驱动因子，从而使得表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs)作为一线治疗肺腺癌的方案开始进入人们视野[2]。随着近年来相关研究的不断深入，越来越多的学者发现：相较于传统化疗而言，吉非替尼用于一线治疗的客观缓解率、耐受性、生活质量以及无进展生存期均有显著性优势，然而随着治疗时间的不断延长，绝大部分患者均会发生获得性耐药[3]。有研究报道证实，吉非替尼等多种靶向药物治疗效果显著的EGFR突变肺癌患者普遍存在Bim高表达，且通过诱导Bim高表达可提高吉非替尼治疗的敏感性，促使肿瘤明显缩小，且生存期延长，生活质量提高[4]。而Bim低表达与表达缺失患者的病情往往进展较快、治疗效果较差。这提示了吉非替尼获得性耐药可能与凋亡蛋白Bim存在密切相关。鉴于此，本文通过研究Bim与EGFR敏感突变肺腺癌患者经吉非替尼一线治疗后获得性耐药的相关性，旨在为临床治疗提供数据支持，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 (1)细胞株来源：PC9与PCR/GR均由广东科研所提供，且PC9对吉非替尼敏感，PC9/GR对吉非替尼耐药：EGFR19外显子突变，不存在T790M突变以及C-met扩增。(2)仪器：超净工作台购自Sigma公司。倒置光学显微镜购自德国Leica公司。二氧化碳(CO2)细胞孵育箱与生物安全柜均购自新加坡ESCD公司。低速离心机、低温高速离心机均购自美国Thermocoulter公司。分光光度计购自美国Thermo Fisher公司。冷冻恒温培养摇床购自美国SI公司。蛋白电泳仪购自美国Bio-Rad公司。低温冰箱购自海尔集团有限公司。流式细胞仪购自BD公司。(3)相关试剂：囊括胎牛血清，青链霉素混合液，DMEM高糖培养液，0.25%胰蛋白酶-EDTA，1×PBS缓冲液，二甲基亚砜(DMSO)，吉非替尼(购自美国阿斯利康公司)，兔抗人BIM一抗、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗、兔抗人GAPDH抗体(均购自美国CST公司)，电泳缓冲液、转膜缓冲液均购自北京酷来搏科技有限公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 研究方法 (1)肺腺癌细胞株PC9与PC9/GR的体外培养：将细胞冷冻管置入37℃水浴国内解冻，使细胞悬液于1 min内彻底融化，随后将细胞悬液转移至含有5 ml DMEM高糖培养液完全培养液的离心管内，以800 r/min作为转速进行离心处理，时长5 min。随后去除上清液，加入5 ml的完全培养液重悬细胞，于显微镜下进行细胞计数，调节细胞密度，混匀后置入细胞培养瓶内持续培养24 h，次日于高倍显微镜下观察细胞污染、特别情况，适当更换培养液。贴壁细胞即为PC9与PC9/GR细胞，待其生长融合度≥90%后进行传代培养。待上述操作结束后通过倒置显微镜明确细胞生长状态，并选择细胞冻存前1 d更换新的细胞培养液。将10%DMEM与90%胎牛血清溶液作为细胞东村也，严格根据细胞传代培养操作收集细胞、离心、去除上清液，并加入适当的冷冻保存液，混合均匀后分别装于标记好的冻存保存管内，并置于-80℃冰箱中过夜。(2)吉非替尼加药：待细胞培养24 h后，小心吸去96孔板内培养上清液，分别于两种细胞中加入0、1、5、10 μmol/L浓度的吉非替尼，将96孔板移至37℃、5% CO2恒温箱内，分别培养24 h与48 h。(3)细胞培养经24 h和48 h后向每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl。培养箱孵育4 h后，轻轻吸取上清，避免结晶物吸出，影响实验结果的准确性。加入200 μl DMSO，置摇床震荡10 min，使结晶物充分溶解。后在570 mm波长的酶标仪下读出OD值。每组药物浓度设置5个复孔，至少重复实验3次。(4)采用Western blot法检测PC9及PC9/GR细胞Bim蛋白表达：取对数生长期细胞铺满6孔板，待细胞彻底贴壁后加入浓度为0、1、5、10 μmol/L的吉非替尼，放置在37℃、5% CO2恒温箱内继续培养48 h。随后进行蛋白的提取以及定量检测，使用扫描仪扫描胶片，使用ImageJ软件进行灰度分析，通过目的与该样本内参GAPDH的灰度比值，计算Bim蛋白相对表达强度。

1.3 观察指标 比较不同剂量吉非替尼作用于PC9、PC9/GR细胞株24、48 h后的抑制率，不同剂量吉非替尼作用于PC9、PC9/GR细胞株24、48 h后的Bim蛋白表达水平。

2 结果

2.1 不同剂量吉非替尼作用于PC9、PC9/GR细胞株24 h后的抑制率比较 在吉非替尼作用24 h后，随着其剂量的不断增加，PC9细胞的抑制率呈逐渐增加趋势，各组间对比差异均有统计学意义(P<0.05)；而PC9/GR细胞抑制率的增加趋势不明显(P>0.05)。见表1。

吉非替尼剂量(μmol/L)PC9PC9/GR0 1.00±0.001.00±0.00125.08±3.49*0.38±7.12526.10±3.01*#5.52±7.191031.72±1.79*#△6.12±7.49F值52.1741.924P值0.0000.185

注：与0 μmol/L比较，*P<0.05；与1 μmol/L比较，#P<0.05；与5 μmol/L比较,△P<0.05

2.2 不同剂量吉非替尼作用于PC9、PC9/GR细胞株48 h后的抑制率比较 在吉非替尼作用48 h后，随着其剂量的不断增加，PC9细胞的抑制率呈逐渐增加趋势，4组间比较差异有统计学意义(P<0.05)；而PC9/GR细胞抑制率的增加趋势不明显(P>0.05)。见表2。

2.3 不同剂量吉非替尼作用于PC9、PC9/GR细胞株24 h后的Bim蛋白表达水平比较 在吉非替尼作用24 h后，随着其剂量的不断增加，PC9细胞株Bim蛋白表达量呈逐渐增加趋势，4组间比较差异有统计学意义(P<0.05)；而PC9/GR细胞株Bim蛋白表达量的增加趋势不明显(P>0.05)。见表3。

吉非替尼剂量(μmol/L)PC9PC9/GR01.00±0.001.00±0.00132.37±4.20*1.98±1.80535.92±3.75*#6.33±10.521038.58±6.83*#△7.74±10.05F值24.5591.142P值0.0000.672

注：与0 μmol/L比较，*P<0.05；与1 μmol/L比较，#P<0.05；与5 μmol/L比较,△P<0.05

吉非替尼剂量(μmol/L)PC9PC9/GR01.00±0.001.00±0.0010.67±0.12*0.60±0.0951.27±0.22*#0.78±0.04102.29±0.20*#△0.79±0.25F值38.7423.423P值0.0000.061

注：与0 μmol/L比较，*P<0.05；与1 μmol/L比较，#P<0.05；与5 μmol/L比较,△P<0.05

2.4 不同剂量吉非替尼作用于PC9、PC9/GR细胞株48 h后的Bim蛋白表达水平比较 在吉非替尼作用48 h后，随着其剂量的不断增加，PC9细胞株Bim蛋白表达量呈逐渐增加趋势，4组间对比差异有统计学意义(P<0.05)；而PC9/GR细胞株Bim蛋白表达量的增加趋势不明显(P>0.05)。见表4。

吉非替尼剂量(μmol/L)PC9PC9/GR01.00±0.001.00±0.0011.10±0.22*0.54±0.2851.74±0.19*#0.60±0.18102.91±0.30*#△0.74±0.20F值45.3763.423P值0.0000.061

注：与0 μmol/L比较，*P<0.05；与1 μmol/L比较，#P<0.05；与5 μmol/L比较,△P<0.05

3 讨论

迄今为止，关于吉非替尼耐药的机制研究不少，主要集中于基因扩增、缺失、突变以及信号通路变化，旁路激活、凋亡受阻等方面[5-7]。关于吉非替尼耐药与凋亡受阻关系的研究并不多见，且大部分集中在促凋亡蛋白Bim和吉非替尼原发性耐药的研究中[8-10]。而促凋亡蛋白Bim与获得性耐药的研究多集中在乳腺癌、胃癌、淋巴瘤、黑色素瘤中进行，临床上不少研究发现，药物获得性耐药可能和Bim基因突变或多态性缺失及蛋白表达异常有关[11-13]。现有研究报道证实：吉非替尼应用于EGFR敏感突变的肺腺癌细胞株获得显著效果时，通过western blot技术检测可发现Bim蛋白的表达存在明显上调，而再敲除凋亡蛋白Bim表达后，会导致原先对吉非替尼敏感的细胞株发生改变，产生耐药性[14-16]。

本文结果表明，在吉非替尼作用24、48 h后，随着其剂量的不断增加，PC9细胞的抑制率呈逐渐增加趋势，且经单因素方差分析可得：各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)；而PC9/GR细胞抑制率的增加趋势不明显(P>0.05)。这提示了吉非替尼敏感细胞株PC9相较耐药细胞株PC9/GR的生长更快。分析原因，笔者认为可能与以下几点有关：(1)与PC9/GR细胞株相比，PC9的贴壁速度更快，而贴壁速度快的细胞，往往分裂增殖能力较强，细胞繁殖速度亦较快。(2)PC9/GR细胞株的贴壁能力较强，消化难度较大，可于一定程度上反映细胞黏附能力较强，而随着细胞粘附力的不断增强，细胞繁殖速度更慢；(3)PC9和PC9/GR均可表达目的蛋白Bim，在予以差异性浓度吉非替尼进PC9与PC9/GR细胞的干预时，PC9细胞株中Bim基础表达量显著增高，而细胞发生凋亡的主要途径是通过促凋亡蛋白Bim所实现，随着Bim蛋白表达的增加，加快细胞凋亡[17,18]。此外，在吉非替尼作用24 h、48 h后，随着其剂量的不断增加，PC9细胞株Bim蛋白表达量呈逐渐增加趋势，且经单因素方差分析可得：各组间对比差异有统计学意义(P<0.05)；而PC9/GR细胞株Bim蛋白表达量的增加趋势不明显(P>0.05)。这表明了敏感细胞株中Bim表达增加，而耐药细胞株中Bim表达相对减少的，提示了Bim对吉非替尼敏感性及耐药性存在密切相关。研究发现[19,20]，吉非替尼产生的获得性耐药与Bim表达下调有密切关系。

综上所述，Bim蛋白减少可能与吉非替尼一线治疗获得性耐药有关，但其具体机制尚且需更深入的研究证实。