6-姜烯酚对溃疡性结肠炎小鼠结肠上皮细胞Notch信号通路的影响*

惠 毅，闫曙光，王 倩，李京涛，魏海梁，单宇鹏

(1.陕西中医药大学，咸阳 712046；2.陕西中医药大学附属医院，咸阳 712000；3.空军军医大学唐都医院肿瘤科，陕西 西安710038)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种以结肠粘膜损伤为主要病理表现的肠道免疫炎症性疾病，其中结肠粘膜持续性损伤是导致该病反复发作，迁延难愈的主要原因，而持续性炎症又是诱发结肠癌的重要高危因素，流行病学显示，我国结肠炎和结肠炎相关肠癌的发病率呈逐渐上升趋势[1-2]，因此，促进受损结肠粘膜的修复是治疗UC并防止其癌变的关键。Notch信号通路是参与胃肠道粘膜修复的经典细胞间信号通路，Notch通过其下游的Hes-1、Math-1蛋白调节着结肠上皮细胞的增殖和分化，在粘膜屏障的维护方面发挥着重要的作用[3]。有研究表明干姜的有效成分6-姜烯酚具有促进胃肠道受损粘膜修复的作用[4-5]，那么其修复肠粘膜的作用是否与Notch相关，尚无相关报道。因此，本研究拟以6-姜烯酚为研究对象，探究其对溃疡性结肠炎小鼠结肠上皮细胞Notch信号通路中关键蛋白Notch-1、Hes-1、Math-1及其mRNA相对表达量的变化，阐明6-姜烯酚基于Notch信号通路修复受损肠粘膜治疗UC的药效作用机制。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂和仪器

柳氮磺吡啶肠溶片(上海信谊嘉华药业有限公司，批号：180601)；6-姜烯酚(纯度98%，宝鸡市辰光生物科技有限公司，批号：17073001)；DSS葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium salt, DSS，美国MP Biomedicals 批号：160110)；RNA提取试剂盒、cDNA合成SuperMix试剂盒、qPCRSuperMix试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)；Notch-1、Hes-1、Math-1抗体(博奥森生物技术有限公司)；引物合成(南京金斯瑞生物科技有限公司)；SuperMiro SM-100超微量分光光度计(英国biochrom有限公司)；IANLONG Real Time PCR System(西安天隆科技有限公司)；4℃离心机(湖南恒诺仪器设备有限公司)；DK-8D型电热恒温水槽(上海一恒科技有限公司)。

1.2 动物分组及造模

清洁级雄性昆明小鼠40只，购于西安交通大学医学院实验动物中心，体重(20±5)g，许可证号：SCXK(陕)2012-003。适应性饲养1周(室温20℃～25℃，常规食水)。小鼠随机分为2组：即空白组(Normal)10只，造模组30只，小鼠溃疡性结肠炎模型参考文献方法[6]：将分子量为36 000～50 000 DSS配置成2%的混悬液，造模组小鼠自由饮用，约10 d后小鼠逐渐出现腹泻，粘液脓血便，饮食量减少等症状，继续饮用至15 d，模型复制成功。随后再次随机法将30只造模小鼠分为模型组(Model)，阳性对照组(柳氮磺吡啶，Sulfasalazine)，6-姜烯酚组(6-Shogaol)。

1.3 给药方式

模型复制成功后，开始灌胃给药，6-姜烯酚组剂量为每次100 mg/(kg·d)；柳氮磺吡啶组剂量为每次100 mg/(kg·d)；模型组和正常组均给予等量生理盐水灌胃每日1次，给药20 d，随后动物处死，取材，检测相关指标。

1.4 病理学组织观察

取病变部位结肠组织，10%甲醛固定24 h，梯度酒精脱水，浸蜡，组织切片，脱蜡，HE染色，光镜下观测组织形态学改变。

1.5 免疫荧光双标法检测结肠粘膜Hes-1、Math-1蛋白的共表达

冰冻切片血清 1∶20 室温封闭20～30 min 后，分别加入抗Hes-1抗体(1∶50)，抗Math-1抗体(1∶50)4℃过夜；荧光二抗(1∶100，FITC标记，呈绿色；1∶100，CY3 标记，呈红色)，37℃孵育1 h；90%甘油(PBS)封片，荧光显微镜下观察。

1.6 RT-PCR方法检测结肠粘膜Notch-1、Hes-1、Math-1 mRNA

刮取结肠粘膜组织，按照RNA试剂盒说明书步骤提取结肠上皮组织中总RNA，超微量分光光度计测定RNA浓度，琼脂糖凝胶电泳检测所提RNA纯度；根据RNA浓度以Oligo(dT)为引物将RNA反转录为cDNA，并检测cDNA浓度，按照RT-PCR试剂盒说明书条件(表1)检测Notch-1、Hes-1、Math-1 mRNA的表达量，相对定量法计算各指标mRNA的ΔCt值。

Tab. 1 Primer sequences used for real time-polymerase chain reaction

1.7 Western blot法检测结肠上皮组织Notch-1、Hes-1、Math-1蛋白表达

刮取结肠上皮组织，制备组织匀浆，裂解结肠组织标本，提取总蛋白，BAC定量，SDS-PAGE 电泳分离蛋白，电转移至尼龙膜，5%干粉牛奶封膜 4℃过夜，抗Notch-1抗体(1∶50)、抗Hes-1抗体(1∶50)、抗Math-1抗体(1∶50)4℃过夜，二抗(1∶100)常温1 h，化学发光法检测目的条带，压X光片曝光，ImageJ软件分析相应蛋白条带的灰度值，计算蛋白的相对表达量。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 小鼠结肠组织的病理改变

正常组小鼠结肠组织结构正常，腺体排列整齐，粘膜上皮组织完整，黏液层光滑；模型组小鼠肠组织结构异常，粘膜表面出现缺损，黏液层部分丢失，大量炎细胞聚集，浸润，腺体破坏甚至丢失；柳氮磺吡啶组小鼠结肠组织结构部分紊乱，粘膜缺损有所改善，部分腺体遭到破坏，炎细胞明显减少；6-姜烯酚组小鼠结肠组织结构基本恢复正常，粘膜缺损明显减轻，受损部位可见少量炎症细胞(图1，见彩图页Ⅰ)。

2.2 6-姜烯酚对小鼠结肠粘膜Hes-1、Math-1蛋白共表达的影响

免疫荧光双标染色结果(图2)显示，正常组小鼠结肠粘膜中Hes-1(红色)、Math-1(绿色)蛋白均呈现低表达；模型组小鼠结肠粘膜固有层肠腺中Hes-1蛋白表达明显增多，可深达隐窝，而Math-1蛋白的表达量显著降低；与模型组比较，柳氮磺吡啶组小鼠结肠粘膜固有层腺体中Hes-1蛋白表达降低、Math-1蛋白表达升高；与柳氮磺吡啶组比较，6-姜烯酚组小鼠结肠粘膜固有层腺体中Hes-1蛋白表达显著降低，Math-1蛋白表达则明显升高(图2见彩图页Ⅱ)。

2.3 6-姜烯酚对小鼠结肠粘膜Notch-1、Hes-1、Math-1 mRNA表达的影响

RT-PCR结果(表2)显示，与正常组比较，模型组小鼠结肠上皮组织Notch-1、Hes-1mRNA相对表达量明显增高(P<0.01)、Math-1 mRNA相对表达量降低(P<0.01)；与模型组比较，柳氮磺吡啶组和6-姜烯酚组小鼠结肠上皮组织Notch-1、Hes-1mRNA相对表达量显著降低(P<0.01)，Math-1 mRNA相对表达量显著增高(P<0.01)；与柳氮磺吡啶组比较，6-姜烯酚组小鼠结肠上皮组织Notch-1、Hes-1mRNA相对表达量显著降低(P<0.01)；Math-1 mRNA相对表达量显著增高(P<0.01)。

GroupNotch-1Hes-1Math-1Normal0.86±0.011.25±0.021.29±0.03Model1.72±0.03∗∗1.77±0.03∗∗1.21±0.04∗∗Sulfasalazine1.52±0.04##1.55±0.02##1.39±0.03##6-Shogaol1.14±0.04##▲▲1.23±0.3##▲▲1.58±0.05##▲▲

**P<0.01vsnormal group；##P<0.01vsmodel group；

▲▲P<0.01vssulfasalazine group

2.4 6-姜烯酚对小鼠的结肠粘膜Notch-1、Hes-1、Math-1蛋白表达的影响

Western blot结果(表3，图3)显示，与正常组比较，模型组小鼠结肠上皮组织Notch-1、Hes-1蛋白相对表达量明显增高(P<0.01)、Math-1蛋白相对表达量降低(P<0.01)；与模型组比较，柳氮磺吡啶组和6-姜烯酚组小鼠结肠上皮组织Notch-1、Hes-1蛋白相对表达量显著降低(P<0.01)，Math-1 蛋白相对表达量显著增高(P<0.01)；与柳氮磺吡啶组比较，6-姜烯酚组小鼠结肠上皮组织Notch-1、Hes-1mRNA蛋白表达量显著降低(P<0.01)；Math-1 蛋白相对表达量显著增高(P<0.01)。

GroupNotch-1Hes-1Math-1Normal0.77±0.081.27±0.071.28±0.03Model1.26±0.07∗∗1.49±0.05∗∗1.21±0.03∗∗Sulfasalazine1.09±0.04##1.42±0.03##1.36±0.05##6-Shogaol0.78±0.06##▲▲1.29±0.06##▲▲1.47±0.04##▲▲

**P<0.01vsnormal group；##P<0.01vsmodel group；

▲▲P<0.01vssulfasalazine group

Fig. 3 Changes of Notch-1, Hes-1 and Math-1 proteins in mice colonic epithelium

A：Normal；B：Model；C：Sulfasalazine；D：6-Shogaol

3 讨论

Notch信号通路是调节肠道上皮细胞增殖和分化的主要通路，是维护肠粘膜屏障、保持其抗菌活性的关键[7]。Notch信号通路由Notch受体、Notch配体和DNA结合蛋白三部分组成。在哺乳动物体内，有四种Notch受体(Notch1-4)，其中Notch-1主要分布在肠道中，Notch-1受体一旦被激活，肠道干细胞开始大量增殖，而后Notch-1受体和配体结合后通过其下游靶基因Hes-1(促进肠道干细胞向吸收细胞系转化)和Hath-1(促进肠道干细胞向分泌细胞系转化，在小鼠为Math-1)在促进肠道干细胞增殖和分化方面发挥着重要的作用，Notch-1活化后会促进Hes-1表达，从而抑制Hath-1的表达，因此适度的活化能促进结肠上皮细胞的不断更新，又保持着吸收细胞和分泌细胞之间正常的分化平衡，但过度活化则导致了吸收细胞增多，分泌细胞减少特别是杯状细胞的数量明显减少[3]。在UC患者的结肠粘膜中，表达Hath-1的细胞消失了，而表达Hes-1的阳性细胞则延伸到绒毛的顶端，杯状细胞明显减少，这表明Notch信号通路的活化增强，过度激活的Notch信号通路促进大量的结肠上皮细胞向吸收细胞系分化，影响了上皮细胞的分化平衡，导致大量杯状细胞消失(正常结肠粘膜固有层肠腺是由大量杯状细胞构成)，杯状细胞的大量缺失不但造成粘膜的缺损，肠道通透性升高，导致肠道细菌易位，免疫功能改变及肠源性感染等发生[8]，同时其分泌的粘蛋白、三叶因子多肽、抵抗素样因子等具有防御作用的物质减少，进一步引起粘膜屏障功能的缺失[9]。因此这一通路被认为是促进结肠粘膜修复的重要靶点，这为我们研究6-姜烯酚促进受损肠粘膜的修复治疗UC提供了思路。

干姜具有温中散寒、回阳救逆，温肺化饮的功效，是治疗胃肠道疾病的临床常用中药，其中含有姜烯酚类、姜二醇、姜二酮、挥发油、胡萝卜苷、棕榈酸等多种活性成份。实验表明6-姜烯酚类能够显著抑制溃疡性结肠炎动物模型体内肿瘤坏死因子，白介素-1等促炎症因子的释放，促进结肠受损部位粘膜的修复而被广泛用于溃疡性结肠炎的相关研究[10-12]，这些研究主要从抗炎的角度揭示了6-姜烯酚的作用机制。抗炎和促受损粘膜修复是溃疡性结肠炎治疗中的关键环节，本次实验结果通过检测6-姜烯酚对小鼠结肠炎模型结肠粘膜Notch信号通路中关键调节因子表达部位和表达水平的变化，明确了6-姜烯酚抑制Notch信号通路过度活化的作用，具体机制为抑制Notch信号通路中Notch-1、Hes-1蛋白的表达，进而抑制增殖的结肠上皮干细胞向吸收细胞系的转化，促进Math-1蛋白表达进而促进结肠干细胞向分泌细胞系特别是杯装细胞的转化，最终维持吸收细胞系与分泌细胞系之间的平衡，促进受损粘膜组织的修复，治疗溃疡性结肠炎。该实验结果为6-姜烯酚治疗溃疡性结肠炎的临床应用和药物开发提供了实验依据。越来越多的证明表明Notch不但能促进受损粘膜组织的修复，还可调节多种固有免疫细胞，特别是巨噬细胞的活性和功能[13]，而巨噬细胞超活化所导致的非可控性炎症是UC反复发作以及结肠炎-癌恶性转化的重要原因[14]。该实验结果为通过干预Notch信号通路进而抑制慢性溃疡性结肠炎的恶性进展并最终降低肿瘤的发生率提供了新的研究思路。