固醇调节元件结合蛋白1干扰片段/激动剂浓度对猪卵母细胞体外发育效果的影响

戴佳格，张紫薇，韩思雨，张东宇，高建明

(北京农学院动物科学技术学院，北京102206)

固醇调节元件结合蛋白(Sterol Regulatory Element Binding Proteins，SREBPs)是一种存在于内质网上的膜连接蛋白的转录因子，其表达受到细胞中胰岛素和固醇水平调节和控制，在胆固醇合成/吸收和脂肪酸合成中发挥作用，在哺乳动物的体内存在两种SREBP，分别为SREBP1和SREBP2。其中SREBP1主要在调节脂肪酸的合成和代谢中发挥作用，参与哺乳动物体内的多种组织器官脂质代谢。脂肪组织中具有较高的SREBP1和过氧化物酶体增殖物激活受体γ的表达[1]。脂肪细胞由前脂肪细胞分化而来，过氧化物酶体增殖物激活受体γ、CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT enhancer binding protein，C/EBP)和脂肪细胞分化决定因子1(α-Adducin，ADD1)/SREBP1等关键转录调节因子共同调控其分化过程[2]。水飞蓟素(Silibinin)添加在子宫内膜癌细胞系培养液中，可以降低子宫内膜癌细胞核内SREBP1的表达及其与脂质合成相关的下游基因(脂肪酸合成酶、硬脂酰辅酶A去饱和酶1、腺苷三磷酸柠檬酸裂解酶、固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白)表达水平，降低了子宫内膜癌细胞中脂质积累[3]。在转移性肾透明细胞癌细胞系中过表达位于1q21.2上的长链非编码RNA，发现细胞中的SREBP1蛋白表达显著升高，表明过表达位于1q21.2上的长链非编码RNA通过SREBP1调控脂质稳态来调控转移性肾透明细胞癌细胞的生长[4]。然而，有研究表明SREBP1对猪卵母细胞外发育有一定影响。Lee等发现在猪体外成熟液中添加50 μmol/L羊毛甾醇，猪成熟卵母细胞中SREBP1等基因表达显著升高，有利于猪卵母细胞的体外成熟[5]。在猪体外成熟液中补充10-9mol/L褪黑素，成猪熟卵母细胞中SREBP1等基因表达显著升高，促进了猪卵母细胞的体外成熟及其孤雌激活胚胎的体外发育[6]。然而，激动或干扰SREBP1的作用对于猪卵母细胞体外成熟效果的影响尚不清楚。

本试验在猪卵母细胞体外成熟22 h分别显微注射SREBP1干扰片段固醇调节元件结合蛋白1-Sus-756(sterol regulatory element binding proteins 1-Sus-756，SREBP1-Sus-756)、固醇调节元件结合蛋白1-Sus-837(sterol regulatory element binding proteins 1-Sus-837，SREBP1-Sus-837)、固醇调节元件结合蛋白1-Sus-1104(sterol regulatory element binding proteins 1-Sus-1104，SREBP1-Sus-1104)和激动剂(50、75、100、125、150和175 nmol/L)，继续培养22 h，体外受精6 h进行胚胎体外培养，并筛选出最佳SREBP1干扰片段和激动剂浓度，观察其对猪卵母细胞体外成熟及体外受精胚胎发育的影响。

1 材料方法

1.1 猪卵母细胞的采集和体外成熟

由北京近郊屠宰场采集的猪卵巢放在加入双抗的37 ℃生理盐水中运回试验室并洗涤3次，浸在该37 ℃生理盐水中。用带12号针头10 mL的注射器以吸取法获取卵巢上直径为3～6 mm卵泡中的卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus-Oocyte complexes，COCs)，经洗卵液洗涤COCs 3遍，体视显微镜下挑选卵丘细胞2层以上、致密、胞质均匀的COCs，移入覆盖矿物油的50 μL TCM199卵母细胞体外成熟液，其中含有1 μg/mL促卵泡素(F2293，Sigma)和1 μg/mL促黄体素(L9773，Sigma)小滴中，置于39 ℃、5%CO2、95%空气、100%相对湿度的CO2培养箱中体外培养22 h。

1.2 显微注射SREBP1干扰片段和激动剂

随机选取体外成熟22 h的卵母细胞用0.1%透明质酸酶脱除卵丘细胞，置于覆盖矿物油50 μL培养液小滴中，采用OLYMPUS IX71倒置显微镜，配以Narishige MMO-202ND油压三维微机械臂(Narishige)进行显微注射。将阴性片段、SREBP1干扰片段(SREBP1-Sus-756、SREBP1-Sus-837以及SREBP1-Sus-1104)分别显微注射入卵母细胞质中，分别为阴性对照组、SREBP1-Sus-756组、SREBP1-Sus-837组、SREBP1-Sus-1104组，未经显微注射的猪卵母细胞为对照组。各组注射量均为10-11L。

将不同浓度的SREBP1激动剂(50、75、100、125、150和175 nmol/L)以及阴性片段分别显微注射入卵母细胞质中，分别为50、75、100、125、150和175 nmol/L组和阴性对照组，未经显微注射的猪卵母细胞为对照组。各组注射量均为10-11L。

将各组别卵母细胞移入覆盖矿物油的50 μL TCM199猪卵母细胞成熟液(不含有促卵泡素和促黄体素)小滴中，在39 ℃、5%CO2、95%空气、100%相对湿度的CO2培养箱中体外成熟至44 h，选择卵周隙明显、卵细胞膜完整、且排除第一极体的卵母细胞用于后续试验。试验中所使用的SREBP1干扰片段及其阴性片段(表1)和激动剂(ADV11-SREBF1Sus)以及阴性片段(ADMax-GFP-Negative control)由中国吉玛公司构建。

表1 SREBP1干扰片段序列Tab.1 SREBP1 interference fragment sequences

1.3 猪卵母细胞体外受精

将猪的细管冷冻精液(百钧达公司)放在50 ℃水浴16 s解冻、加入10 mL精液稀释液(百钧达公司)后，以1 500 r/min离心5 min，弃上清液加入5 mL体外受精液混匀后，以1 500 r/min离心5 min，弃上清液加入5 mL获能液混匀后，加入培养箱中获能30 min。将获能处理后的上游精液以l×106个/mL的终浓度，按试验组别分别置于每滴中含有10～15枚成熟卵母细胞的mTBM受精液中，受精6 h备用。

1.4 胚胎体外培养

将各组体外受精6 h的受精卵分别用添加0.4%牛血清白蛋白的NCSU-23胚胎培养液清洗3遍，分别移入39 ℃、5%CO2、95%空气、100%相对湿度的CO2培养箱中平衡4 h的NCSU-23胚胎培养液清洗3遍的50 μL液滴中，每滴15枚左右，进行体外培养。分别于培养48、72、96、120和168 h观察其2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑椹胚、囊胚率，间隔48 h换液。

1.5 数据处理，统计学分析

应用SPSS 25.0统计软件的单向方差分析和SNK多重比较法对数据进行分析和差异显著性比较。结果以平均值±标准差表示，P<0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著。

2 结 果

2.1 SREBP1干扰片段对猪卵母细胞体外成熟及其体外受精胚胎体外发育的影响

在猪卵母细胞体外成熟第一极体排出率和体外受精胚胎体外发育囊胚率上，SREBP1-Sus-756、SREBP1-Sus-1104、SREBP1-Sus-837组与对照组和阴性对照组之间均差异显著(P<0.05)，对照组和阴性对照组之间差异显著(P<0.05)；SREBP1-Sus-1104组与SREBP1-Sus-756组和SREBP1-Sus-837组之间差异显著(P<0.05)，而SREBP1-Sus-756组和SREBP1-Sus-837组之间差异不显著(P>0.05)，见表2和表3。可见，SREBP1-Sus-1104干扰片段对猪卵母细胞体外成熟及其体外受精胚胎体外发育的抑制效果均最好。

2.2 SREBP1激动剂对猪卵母细胞体外成熟及其体外受精胚胎体外发育的影响

猪卵母细胞体外成熟第一极体排出率，125 nmol/LSREBP1激动剂组显著高于阴性对照组(P<0.05)；50、75、100和150 nmol/LSREBP1激动剂组与阴性对照组之间差异不显著(P>0.05)；175 nmol/LSREBP1激动剂组显著低于阴性对照组(P<0.05)，对照组与其他各组具有显著差异(P<0.05)。125 nmol/LSREBP1激动剂能够显著提高猪卵母细胞体外成熟效果，见表4。

表2 SREBP1干扰片段对猪卵母细胞体外成熟的影响Tab.2 Effects of SREBP1 interfering fragments on porcine oocytes in vitro maturation

注：同一列，不同字母之间表示差异显著(P<0.05)，相同字母之间表示差异不显著(P>0.05)。

Note: The values denoted by different letters within the same column represent significant difference at 0.05 level (P<0.05), the same letters indicate no significant difference (P>0.05).

注：同一列，不同字母之间表示差异显著(P<0.05)，相同字母之间表示差异不显著(P>0.05)。

Note: The values denoted bydifferent letters within the same column represent significant difference at 0.05 level (P<0.05), the same letters indicate no significant difference (P>0.05).

猪体外受精胚胎体外发育囊胚率，75、100和125 nmol/LSREBP1激动剂组显著高于阴性对照组(P<0.05)，其中125 nmol/LSREBP1激动剂组显著高于75和100 nmol/L激动剂组(P<0.05)，而二者之间差异不显著(P>0.05)；50和150 nmol/LSREBP1激动剂组与阴性对照组之间差异不显著(P>0.05)；175 nmol/LSREBP1激动剂组显著低于阴性对照组(P<0.05)，对照组与其他各组具有显著差异(P<0.05)。125 nmol/LSREBP1激动剂能够显著促进猪体外受精胚胎体外发育，见表5。

表4 不同浓度SREBP1激动剂对猪卵母细胞体外成熟的影响Tab.4 Effects of different concentrations of SREBP1 agonists on porcine oocytes in vitro maturation

注：同一列，不同字母之间表示差异显著(P<0.05)，相同字母之间表示差异不显著(P>0.05)。

Note: The values denoted by different letters within the same column represent significant difference at 0.05 level (P<0.05), the same letters indicate no significant difference (P>0.05).

表5 不同浓度SREBP1激动剂对猪体外受精胚胎体外发育的影响Tab.5 Effects of different concentrations of SREBP1 agonists on porcine oocytes in vitro fertilized embryo development

注：同一列，不同字母之间表示差异显著(P<0.05)，相同字母之间表示差异不显著(P>0.05)。

Note: The values denoted by different letters within the same column represent significant difference at 0.05 level (P<0.05), the same letters indicate no significant difference (P>0.05).

3 讨 论

本研究中，在猪卵母细胞成熟过程中干扰SREBP1的作用，显著降低了卵母细胞体外成熟和体外受精胚胎体外发育。这可能是由于卵母细胞在体外成熟过程中脂质难以合成，无法满足卵母细胞成熟过程中的物质和能量所需。在人肺癌细胞系中干扰B7-H3的表达，SREBP1的表达水平显著下降，细胞中脂质和甘油三酯含量显著下降，其脂质合成能力显著降低[7]。反式-10，顺式-12共轭亚油酸通过下调SREBP1的表达水平，从而抑制山羊乳腺上皮细胞中脂肪酸合成[8]。另外，有研究表明SREBP1对人胚胎肾细胞293的有丝分裂过程具有调控作用[9]。

然而本研究中，在猪卵母细胞成熟过程中适量的激动SREBP1，有利于卵母细胞体外成熟和IVF胚胎体外发育。有研究表明，10-9mol/L褪黑素可以通过调控SREBP1等基因表达使在体外成熟的猪卵母细胞中脂肪酸的含量显著提高，有利于猪卵母细胞的体外发育。T0901317(肝X受体激动剂)通过激活SREBP1的表达，增加了牛乳腺细胞中一些不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸的含量[10]。在牛乳腺上皮细胞中过表达SREBP1，激活了脂肪酸合成酶基因的表达，有利于细胞中脂滴的生成[11]。本研究表明过高的SREBP1激动剂浓度对猪卵母细胞体外成熟和IVF胚胎体外发育有一定的阻滞作用，这可能是因为在卵母细胞中会导致大量的脂质堆积。Hiraga研究也表明猪卵母细胞中脂滴含量高则降低体外受精囊胚发育率[12]。有关SREBP1对猪卵母细胞体外成熟及体外受精胚胎体外发育的作用机制是下一步进行的研究内容。

4 结 论

SREBP1干扰片段对猪卵母细胞体外成熟及体外受精胚胎的发育效果有抑制作用，其中SREBP1-Sus-1104干扰片段的作用最强。125 nmol/LSREBP1激动剂对猪卵母细胞体外成熟及体外受精胚胎的发育效果有显著促进作用。