炎性肠病Hepc、Hb、游离DNA和血清CRP变化与疾病活动程度的关系

张慎听

炎症性肠病(IBD)是主要影响消化道功能的一种慢性非特异性炎性疾病，发病率逐年上升，主要类型有溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)[1]。目前，IBD的病因尚不清楚，需要综合临床表现，实验室和影像学检查，内窥镜检查和组织病理学检查来进行诊断[2]。近年来，IBD的实验室检测取得了很大进展，不仅可以用于辅助IBD的诊断，还有利于疾病的分层和预后评估，在IBD的临床诊断和治疗中发挥重要作用[3]。研究表明，铁调素(Hepc)可能与IBD的发病机制和炎症反应有关，IBD引起的局部失血可降低体内血浆血红蛋白(Hb)水平；游离DNA是细胞外DNA，存在于体液如血液和脑脊液中，具有最小的游离DNA含量[4]。研究表明，游离DNA与各种疾病有关，如肿瘤、心肌梗死、创伤和系统性红斑狼疮等[5]。本次研究选取经肠道镜检证实为IBD的患者120例，探讨IBD患者血浆Hepc、Hb、游离DNA、CRP的变化及其临床意义，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选取2016年1月-2018年8月我院经肠道镜检证实为IBD的患者120例作为病例组，选取健康对象60例作为对照组。病例组患者年龄17～65岁，平均(44.6±12.1)岁；男68例，女52例；体质量指数(BMI)(23.1±2.2)kg/m2，其中UC 70例(活动期40例，缓解期30例)，CD50例(活动期27例，缓解期23例)。对照组患者年龄19～65岁，平均(46.2±11.8)岁；男30例，女30例； BMI(23.3±2.1)kg/m2。2组研究对象的年龄、性别、BMI比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。诊断及入选标准：①炎性肠病的诊断标准参考《炎性肠病诊断与治疗的共识意见(2012年广州)》中的标准；②经肠道镜检查、病理学活检证实；③UC活动期标准为Mayo评分≥2分，CD的活动期判断标准为炎性肠病活动指数≥150分；④入组对象近3个月未接受相关治疗措施；⑤本研究符合《赫尔透辛基宣言》相关医学伦理规定，获得研究对象的知情同意。

排除标准：①恶性肿瘤；②肠道梗阻、穿孔；③严重出血、凝血功能障碍；④自身免疫性疾病；⑤其他肠道疾病。

1.2 指标检测方法:游离DNA的提取和检测。抽取患者2 mL空腹静脉血，加入抗凝剂，1 000 r/min离心5 min，分离血清，得到的血浆以6 000 r/min离心5 min，分离血浆并储存在-80 ℃的冰箱中。使用血清/血浆核酸纯化试剂盒，使用0.5 mL血浆提取游离DNA，并严格按照试剂盒说明进行操作，定容到100 μl的AVE缓冲液中。使用Quant-iTTM Pico Green dsDNA定量试剂盒，并仔细按照说明操作。取50 μl提取的游离DNA，加至黑色96孔微孔板，加入50 μl 200倍稀释的Pico Green荧光染料，在室温下孵育10 min，并使用Spectra Max i3荧光微板测定系统在480 nm的激发波长和520 nm的发射波长下测量荧光值。使用已知浓度为0～1 000μg/ L的Lambda DNA(Invitrogen，USA)作为标准品，计算样品浓度。血浆Hb、CRP、Hepc水平检测，所有患者在禁食后清晨抽取12 mL外周静脉血，取3 mL血液检测血浆Hb水平；再取6 mL进行3 000 r / min离心10 min，离心半径8.5 cm分离血清，之后通过酶联免疫吸附试验检测CRP和Hepc的水平。试剂盒购自上海浩然生物科技有限公司。

1.3 炎性肠病活动指数:IBD活动性标准:UC依据Mayo评分，包括腹泻、便血、内镜下黏膜病变、医师病情评估等，采用4级评分法(0～3分)，其中<2分为缓解期，≥2分为活动期；CD依据CD活动指数(CDAI评分),包括腹泻、腹痛、一般情况、肠外表现、腹部包块、贫血、体质量等,采用人工计分法，总分258分，其中<15分为缓解期，≥150分为活动期。

2 结果

2.1 病例组和对照组Hepc、Hb、游离DNA与血清CRP测定值比较:病例组Hepc、游离DNA与血清CRP高于对照组(P<0.05)；病例组Hb测定值低于对照组(P<0.05)，见表1。

表1 2组患者Hepc、Hb、游离DNA与血清CRP测定值的比较

2.2 UC组患者活动期和缓解期Hepc、Hb、游离DNA与血清CRP测定值的比较：UC活动期患者的Hepc、游离DNA与血清CRP高于UC缓解期患者(P<0.05)，Hb值低于UC缓解期患者(P<0.05)，见表2。

表2 UC组患者活动期和缓解期Hepc、Hb、游离DNA与血清CRP值的比较

2.3 CD组患者活动期与缓解期Hepc、Hb、游离DNA与血清CRP测定值的比较：CD活动期患者的Hepc、游离DNA与血清CRP高于UC缓解期(P<0.05)，Hb值低于CD缓解期(P<0.05)，见表3。

表3 CD组患者活动期和缓解期Hepc、Hb、游离DNA与血清CRP值的比较

2.4 UC、CD患者活动期Hepc、Hb、游离DNA、血清CRP与活动情况的相关性比较:UC、CD活动期患者的Hepc、游离DNA与血清CRP分别与Mayo评分、CDAI评分呈显著正相关性(P<0.05)，Hb值与Mayo评分、CDAI评分呈负相关性(P<0.05)，见表4。

表4 相关性分析结果

3 讨论

免疫DNA技术定量检测的快速发展促进了游离DNA研究的扩展，不仅肿瘤患者的游离DNA变化，而且自身免疫性疾病、炎症性疾病、心肌梗死、创伤等患者的血液游离DNA也会变化。游离DNA作为一种非侵入性测试指标，将成为一种新的生物标志物用于早期诊断，疗效判断和疗效监测[4-6]。PicoGreen试剂是近年来使用的一种新型荧光染料，PicoGreen荧光比色法可以高灵敏度特异性地结合双链DNA，与荧光定量PCR结果在测定游离DNA上具有高度一致性，是一种简单、快速、高效的DNA定量检测方法[7]。

游离DNA的产生机制尚不清楚，血浆中游离DNA的积累可能是由于大量细胞死亡，以及由炎症反应引起的DNA过度释放，游离DNA可反映细胞损伤和炎性病变的程度[8]。不同疾病中游离DNA升高的机制是不同的，肿瘤是发生异常的凋亡，心肌梗死和创伤是机体发生大量细胞坏死或死细胞，系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎等疾病主要是由于游离DNA和其他蛋白质结合的复合物清除过程受到阻碍，以及由炎症反应引起的DNA的过度释放[9]。该研究结果表明，IBD患者的游离DNA含量高于健康对照组，差异具有统计学意义。活动性CD和UC患者的游离DNA含量高于缓解期，差异有统计学意义，含量的升高与IBD中肠炎症反应的发展和进展相关，对游离DNA的检测有助于识别活动期的IBD。

CRP是目前IBD疾病活动临床评估的最常见指标。血浆游离DNA含量与CRP和IBD活性呈正相关性，进一步证明游离DNA可用作监测IBD活性的指标[10]。由于其他因素，CRP无法真实反映患者的疾病活动，单一指标对患者的诊断价值有限[11]。研究表明，IBD发病后会发生肠道出血并伴有不同程度的贫血，导致体内Hb水平降低，提示Hb水平可能反映IBD的发生[12]。Hepc是一种小分子多肽，受体内铁负反馈调节，具有调节体内铁代谢的功能。当人体缺铁时，它可以抑制Hepc的产生，增加肠道铁的吸收，促进巨噬细胞的铁和肝脏铁元素的释放。当身体含铁过量时，它可以刺激Hepc的形成，抑制肠道中铁的吸收，避免铁过载[13-15]。研究组Hepc高于对照组(P<0.05);病例组的Hb测量值低于对照组，活动期CD和UC活动期患者的Hepc高于缓解期，Hb测量值低于缓解期患者。表明患有肠黏膜免疫反应的患者肠道菌群，感染或其他因素不能有效抑制T细胞、巨噬细胞等，导致免疫失衡，不仅损害胃肠黏膜，导致肠道失血，表现随着Hb水平的降低，它将刺激Hepc的产生并增加肠道中铁的吸收，促进巨噬细胞中铁和肝的释放以补偿缺铁症状，并增加IL-6等炎症介质，与Hepc共同参与炎症反应，导致铁的吸收和利用障碍，患者的贫血等症状加重，导致IBD的发生。相关性显示，UC、CD活动期患者Hepc、游离DNA和血清CRP分别与Mayo评分、CDAI评分呈显著正相关，Hb测定值与Mayo评分、CDAI评分呈负相关性。

综上所述，与健康人群相比，IBD患者血浆Hepc、Hb、游离DNA与血清CRP变化显著，并且与疾病活动情况有一定的关系，检测上述因子水平可能是评估患者病情的重要参考指标。