血小板功能检测的常用方法及容易忽略的影响因素

贾媛 白世茹 李如意 杜荣品

050051 石家庄，河北省人民医院心内科

动脉血栓性疾病是一类全球性疾病，具有发病率高、致残率高、死亡率高的特点，严重危害着人类健康[1]。血小板激活是血栓性疾病发生发展的关键步骤，因此抗血小板治疗是降低血小板反应性，阻止血栓形成的关键方法，也是预防主要不良心血管事件的有效措施。然而近年来，随着新型支架的引入、介入技术的改进及强效抗血小板药物的出现，大出血的发生率有所增加。缺血和出血风险都有可能对预后产生负面影响[2]。目前血小板功能检测的标准和方法尚不统一，且各种方法都存在自身的局限性。因此，各国学者都在探索能够有效检测抗血小板疗效的工具，希望它能够预测患者发生不良心血管事件的风险及评估出血风险。本文比较目前常用的几种血小板功能检测方法，并对临床中容易被忽略的几个因素进行概述。

1 常用的血小板功能检测方法

1.1 光学比浊法(light transmission aggregometry，LTA)

LTA作为一种检测血小板聚集功能的方法，最初在1960年提出，是测定血小板聚集度的传统“金标准”。LTA的检测原理是将血液通过离心方法分离出富含血小板的血浆，分别加入不同促聚集物质(ADP、胶原、肾上腺素、花生四烯酸等)，由于血小板聚集、沉淀，其透光度增加，用比浊仪检测透光度的变化来评估血小板的聚集功能。其优点为价格低廉、应用广泛。其缺点为检测所需血标本量大；没有一个标准化的操作流程，实验的可重复性差；并且需专门分离富含血小板的血浆，耗时耗力。LTA虽是近些年来检测血小板功能最常用的方法，但离心后的血液样本去除了红、白细胞，且离心的过程也会导致血小板的激活，因此该方法不能准确反映体内血小板聚集和活化的水平。而且，血脂升高也会影响血浆透光度，从而影响检测结果，故LTA不适用于高脂血症患者。

1.2 血栓弹力图

血栓弹力图采用全血直接进行血小板聚集功能的检测。其原理为在体外模拟缓慢静脉血流，当全血被诱导剂激活后，血液凝固成血栓，用感受器测定血栓形成的时间和数量，并由计算机绘制血凝速度和强度曲线。其优点为操作简便、快速，易规范，重复性较好。而缺点为与LTA法检测结果的一致性仍有争议；血栓弹力图反映动态血液凝固全过程，因此其主要影响因素包括血小板、凝血因子、纤维蛋白原等血液成分之间的相互作用、血凝的速度、纤维蛋白溶解系统活性的高低等。血栓弹力图显示患者的凝血全貌，可在一定程度上辅助指导成分输血、判断肝素疗效、评估抗血小板用药效果和诊断纤溶亢进等，从而指导临床医师选择更加合理的诊疗方案。

1.3 阻抗法

阻抗法又称电阻法，其根据电阻抗原理，通过放大全血样品中的阻抗变化来测定血浆中血小板聚集程度。工作原理为加入血小板激活剂后，血小板变形并粘附于电极上，导致电流变小。通过记录浸泡于全血的电极间微小电流或电阻变化而形成的聚集曲线，观察体外血小板聚集变化。其优点为操作简便、需血量少；全血检测；无需处理血样。而缺点为耗时长；对小聚集物形成不敏感；每次需清洗电极；电极日常维护要求高。该方法多用于实验研究，而临床应用较少。

1.4 血管舒张剂刺激磷酸蛋白(vasodilator-stimulated phosphoprotein，VASP)流式细胞术测定

VASP为血小板内蛋白质，是ADP受体P2Y12下游信号通路产物，当P2Y12受体被ADP激活后，VASP被蛋白激酶磷酸化。其检测原理为对细胞膜通透处理后，加入抗VASP磷酸化荧光抗体，即可采用流式细胞术对VASP进行定量。其优点包括P2Y12信号通路特异性强；与LTA检测结果相关性较好；重复性好；检测结果能够用于预测心脑血管不良事件的发生。而缺点为操作复杂，费用较贵。因流式细胞仪测定需要特异的抗体，且流式技术检测费用昂贵，故该检测方法目前多用于实验研究而尚未在临床上常规开展。

1.5 Verify-Now快速血小板功能分析仪

Verify-Now是目前欧美国家应用较多的血小板功能检测方法。检测原理：在一个试剂盒内混有3种血小板激活剂之一(ADP、花生四烯酸、凝血酶受体激活肽)和纤维蛋白原包被的小珠。加入全血后血小板受激活剂作用而活化，其表面Ⅱb/Ⅲa受体复合物与小珠表面的纤维蛋白原交联，使血小板聚集于小珠表面，试剂盒内透光性增强。其优点为操作简便、快速；床旁检测；需血量少；全血检测，无需处理血样；可分别检测阿司匹林、氯吡格雷、Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂的效应。而缺点为无调校方法，价格贵。目前国外多项关于血小板功能检测的大型研究均采用此种检测方法。

1.6 PFA-200血小板功能分析仪

血小板功能分析仪(PFA)检测原理：将检测管中的全血标本吸入富含胶原纤维、肾上腺素或ADP等血小板聚集诱导剂的孔隙，在剪切力的作用下，测定血小板血栓封闭孔隙所需的时间(封闭时间)来反映血小板的聚集率。其优点为床旁检测，检测时间短，检测样本量少。而缺点为操作流程繁琐，标准化差。

1.7 P选择素

P选择素是一种在活化血小板和内皮细胞表面起粘附分子作用的蛋白。检测原理：血小板活化导致P选择素转移到细胞表面，利用流式细胞法定量检测血小板P选择素的表达。相关研究已经证实，循环中可溶性P选择素与血管性疾病的诊断和预后相关。与其他测试不同的是，它的优点在于血液样本可以固定保存且测试时间在28 d(甚至35 d)内有效。而缺点为P选择素的表达在个体之间有很大的差异，且没有一个固定的界值[3](表1)。

表1 常用血小板功能检测方法的优缺点

2 各种检测方法之间的相关性

ten Berg博士牵头的POPULAR研究入选择期经皮冠状动脉介入术患者，给予阿司匹林和氯吡格雷双联抗血小板治疗，分别比较了LTA、Verify-Now、Plateletworks、IMPACT-R、PFA-100、改良PFA P2Y共6种血小板功能检测方法，结果显示，仅LTA、Verify-Now和Plateletworks的检测结果与临床结局显著相关，但各种血小板功能检测方法总体预测价值不高，各方法的曲线下面积(AUC)为0.50～0.63，敏感度和特异度均<65%，并且这些检测方法均不能预测患者的出血风险[4]。因此，不同血小板功能检测方法的总体临床预测价值并不高。

王曦等[5]的研究证实了各种方法之间具有明显的相关性，LTA与血栓弹力图的相关系数为0.6(P<0.05)，LTA与Verify-Now的相关系数为0.693，血栓弹力图与Verify-Now的相关系数为0.564(均为P<0.05)。RECLOSE 2-ACS研究纳入了1 789例急性冠状动脉综合征患者，在接受负荷剂量氯吡格雷治疗的患者中，用LTA检测残余血小板反应性，并随访2年终点事件，发现高残余血小板反应活性与主要不良心血管事件的发生密切相关(P<0.001)[6]。杨雅薇等[7]的研究显示，Verify-Now与血栓弹力图、VASP、PL-11检测的血小板抑制率结果有一定的相关性，其中PL-11系统的敏感性和特异性最高。Zhang等[8]的一项关于血小板功能检测对经皮冠状动脉介入术后患者临床预后影响的荟萃分析显示，LTA、MEA对主要不良心血管事件的预测作用较明确，但Verify-Now和VASP的预测作用有待进一步证实。

常规抗血小板治疗过程中，一般无需进行血小板功能测定，对特殊高危患者尤其是缺血高风险或调整抗血小板治疗策略时，应进行血小板功能检测，以帮助提升抗血小板药物疗效及用药安全性。从血小板聚集成血栓的过程需要经过血小板粘附、聚集、收缩、分泌、释放及凝血因子参与等多个步骤，血小板被激活后不仅影响凝血系统，还介导白细胞激活及组织因子表达，以上诸多复杂效应并不能单凭血小板聚集率这单一指标显示。不可否认，血小板功能检测是评价抗血小板药物疗效的参考指标之一，但采用血小板反应性评价血小板功能还是不够的。各检测机构应根据自身条件及不同检测手段各自的优缺点，开展相应的血小板功能检测。LTA法作为最经典的血小板功能检测方法，是诊断血小板功能缺陷病、监测抗血小板治疗、评价其他方法的“金标准”，根据目前国内的应用现状，建议以LTA法为基础，辅以血栓弹力图、Verify-Now或PFA-200等其他手段。

3 临床上容易被忽略的影响血小板功能检测的因素

3.1 吸烟

吸烟与心肌梗死后更好的预后相关，这一悖论在溶栓时代被描述为“吸烟者悖论”。最近，这个术语也被用来描述吸烟与血小板功能的关系。相关研究发现，临床上口服氯吡格雷的吸烟患者比不吸烟患者显示出更低的残余血小板反应性，这一现象通常归因于：(1)吸烟引起的氯吡格雷活性代谢物产量增加；(2)吸烟者的高血红蛋白水平。不过，The GEPRESS研究检测了718例接受经皮冠状动脉介入术的非ST段抬高型心肌梗死患者在口服氯吡格雷之前和之后1个月时的血小板功能，否定了以上两种原因[9]。目前这种现象的机制尚不明确，需要进一步研究。

3.2 标本运输过程中震荡

血小板最大聚集率和平均聚集率是临床上判断抗血小板聚集药物疗效的重要指标，相关研究提示，震荡后血小板最大聚集率和平均聚集率高于震荡前，差异有统计学意义。表明震荡容易造成血小板体外激活，使血小板功能检测结果偏高。故在标本运输过程中应避免不当的震荡，以免影响临床对患者血小板功能的评估[10]。

3.3 标本放置时间

程卫红[11]对70名健康人采集血液标本后，应用全自动血液细胞分析仪进行检测，发现随着放置时间的推移，血小板的各项实际检测值随之升高，尤其是在采集4 h后最为显著。朱远等[12]研究了不同放置时间对血小板功能检测仪PL-11结果的影响，发现花生四烯酸诱导血小板聚集受时间影响较小，但ADP与胶原诱导血小板聚集随着标本放置时间的延长，血小板聚集率降低。因此，应用PL检测血小板功能时，花生四烯酸诱导应在采血后4 h内完成，ADP和胶原诱导应在采血后2 h内完成。有关LTA检测血小板功能的研究推荐，检测时间最好为采血后30 min至2 h，不能超过4 h[13]。

3.4 体育锻炼

Lundberg等[14]的一项横断面研究探讨了运动对抗血小板疗效的影响，发现经常运动者血小板基础反应性较低，对前列环素的抗聚合作用更敏感，双联抗血小板治疗更有效。因此，积极的体育运动会增加血小板对药物的敏感性，建议在个性化和优化抗血栓治疗策略时，适当进行体育锻炼。

4 血小板功能检测的新进展

实验研究发现，在家兔全血中加入抗原抗体复合物时，凝血时间明显缩短，而不含血小板的血浆则无此现象，这是因为免疫复合物使补体活化进而通过免疫粘着导致血小板聚集。血小板血栓形成与补体激活过程相似，两个系统之间可以交叉激活。Sauter等[15]发现了冠状动脉疾病患者血小板上激活的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa和血小板补体C3aR共同表达的情况，且血小板补体C3aR的表达与糖蛋白Ⅱb/Ⅲa的活化呈正相关。血小板上的C3a/C3aR轴可调节血栓形成的不同步骤，其机制是补体片段C3a活化后C3aR介导的信号调控Rap1b的激活，促进血小板聚集和血栓形成。以上研究均表明，补体活化可能激活血小板进而导致血栓形成，强调了心血管疾病中补体失调激活的有害作用，提示我们可进一步研究参与动脉粥样硬化血栓形成的补体成分。血小板激活的机制、参与血小板激活的受体等信号分子在病理性血栓形成、生理性止血过程中的作用非常复杂，明确这些信号分子的作用，应有助于研发更理想的血小板功能测定方法。

5 展望

近年报告的关于血小板功能检测对临床心血管事件预测作用的几个大型临床试验ANTARCTIC、ARCTIC、GRAVITAS和TriggerPCI均以阴性结果收尾，因此各国的抗血小板治疗指南不推荐将血小板功能检测作为常规检测，仅可适当用于部分缺血高危患者。虽然大型试验的阴性结果使血小板功能检测技术处在一个低迷时期，不过众多研究证实了血小板高反应性与经皮冠状动脉介入治疗后血栓事件(尤其是支架内血栓)具有强相关性，可用于预测临床缺血事件的发生[16]。这与相关理论和大量临床经验均吻合。

人体内血栓形成的环境非常复杂，当前的血小板功能检测只能从某一方面或几个方面反映血小板受抑制的程度，并不能反映出体内血小板功能的真实水平。理想的检测方法应该满足以下几点：经济、准确、操作简单、重复性良好，执行过程标准化，能够提供最佳的抗血小板的治疗范围。近年来有关抗血小板新靶点受体(如血小板上的C3a/C3aR轴)的出现为临床检测血小板功能提供了新思路。同时，我们期待更理想的新型血小板功能检测方法的出现。

利益冲突：无