丹参水提取液在小鼠体内抑菌效果及大肠杆菌感染的预防作用

王天祎，侯佳佳，胡 迪，申维维，崔德凤，张永红

(北京农学院动物科学技术学院/兽医学(中医药)北京市重点实验室，北京 102206)

伴随着抗生素产生的耐药性及兽药残留等问题，人们逐渐将目光转移到中草药，利用中草药开发新型抗菌药物已经成为当下热点问题。中草药在机体内抗菌的同时，还会对调节和改善机体状态起到良好作用。在减抗限抗的大环境下，开发研制可以预防控制畜禽肠道疾病制剂已成为重要课题。在养殖业生产实践中，利用中药调节畜禽肠道菌群，大多以中药单味药物或是组方进行治疗和药效学研究[1-2]，并已取得良好效果[3]。

一些单味中草药具有抗菌作用[4]，如蒲公英、连翘等清热解毒类药物和五味子等收敛类药物等[5]。李志茹等[6]采用水煎醇提的方式分别从枸杞和苦参中提取中药单味提取药液对大肠杆菌、白色葡萄球菌等均有抑制其生长的作用；程强等[7]验证四季青水煎液具有抗菌消炎的作用，对产超广谱β-内酰胺酶(Extended Spectrum Beta-Lactamases，ESBLs)大肠埃希菌、甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(Methicillin Staphylococcus aureus，MSSA)等生长具有抑制作用。陈虹[8]从56种中草药初筛选出12种中草药，以其水提取物分别对8种畜禽肠道病原菌进行抑菌试验，这12种中草药有着不同抗菌谱，且抑菌效果不一致，黄连、石榴皮、艾叶、黄芩与五倍子均对大肠杆菌抑菌效果较明显，黄连、石榴皮、黄芩对鸡白痢沙门菌有抑菌效果。

丹参是中国传统中药的一种，唇形科植物，干燥根及根茎。拥有通经止痛、活血祛瘀及凉血消痈等功效[9]。丹参有抗氧化、抗菌消炎、保护心脏、抗肝损伤等一系列功效[10-11]。丹参可用于临床肝炎、肿瘤、冠心病等治疗[12-13]，具良好效果。

大肠杆菌在自然界中分布十分广泛[14]，空气、土壤、水源中均有大肠杆菌的存在，是一种极易被畜禽感染到的病原菌；是引起畜禽腹泻的主要致病菌之一。感染大肠杆菌常常会导致患病动物因脱水而致死[15]，对畜牧业造成极大损失[15]。抗生素的使用的确大大降低由大肠杆菌引起的畜禽腹泻，然而，随着人们对健康的日益重视，畜禽产品中抗生素的残留问题越来越受到更广泛关注[16]。抗生素滥用必定会造成显而易见的危害，例如在杀死畜禽机体内有害菌的同时必定会损害一些有益的菌群[17]，从而打破畜禽胃肠道内的菌群平衡状态；同时滥用抗生素还会导致一些致病菌产生高度的适应性及耐药性并且大量繁殖[17]，导致耐药菌株的产生[15]，这就大大增加治疗的难度。选择合适的中兽药针对抗生素进行替代已经成为人们日益关注的问题。中药的抗菌机制具有多重性[18]，中草药不仅活性成分十分复杂，绝大多数的方剂又是复方药剂，中药对细菌的抗生长作用是通过对菌体和动物机体双重调节实现的[19]。增加体外动物抑菌试验十分必要。

本研究侧重研究小鼠在饲喂丹参水提取液后肠道内乳酸杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌数量的变化趋势。进一步分析小鼠肠道内乳酸杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的竞争性抑制作用，说明肠道内乳酸杆菌数量是否可预防致病菌对宿主的侵害。为畜禽饲养过程中，对益生菌起到促进作用以及对病原菌的抑制提供理论指导，对丹参这一中草药在养殖业的推广具有重要意义。同时通过对饲喂一段时间丹参水提取液的小鼠进行大肠杆菌O101攻毒试验，进行体内抑菌试验，通过观察小鼠的存活率以及攻毒后肠道菌群计数判定丹参水提取液的体内抑菌效果。本研究的主要意义在于有助于阐明丹参在体内及体外的抗菌、抑菌作用，从而对丹参在畜牧养殖领域推广应用提供重要的参考依据。

1 材料和方法

1.1 仪器、试剂与材料

低温冰箱(三洋公司)；超净工作台(东联哈尔仪器公司)；超纯水制备仪(力康发展公司)；全自动高压灭菌锅(新华医疗器械有限公司)；恒温干燥箱(泰斯特仪器有限公司)；涡旋震荡器(其林贝尔仪器制造有限公司)；旋转蒸发器(亚荣生化仪器厂)；循环水真空泵(亚荣生化仪器厂)；全温度恒温培养振荡器(智诚分析仪器有限公司)；电用中药煎药壶(天际振东有限公司)；电热恒温培养箱(一恒科学仪器有限公司)；0.7 cm打孔器(得力文具用品有限公司)；显微镜(奥林巴斯公司)；移液枪(艾本德公司)。

营养肉汤、麦康凯琼脂、营养琼脂(奥博星)；无水乙醇；灭菌生理盐水(四药)。

健康同龄20日龄昆明小鼠100只，体质量18 g±2 g；40日龄昆明小鼠60只，体质量35 g±2 g，购于实验动物养殖厂(兴隆饲养厂)。

大肠杆菌(O101)，由北京农学院兽医学(中医药)北京市重点实验室保存。丹参，2018年7月购于北京市昌平区回龙观永旺同仁堂药店。

1.2 试验方法

1.2.1 试验分组 小鼠适应性饲喂7 d后。将100只体质量在18 g±2 g试验鼠称量体质量，每组25只，6～7只一笼进行随机分组。设空白组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。用苦味酸对小鼠被毛进行标记，标记编号为1、2、3、4、5、6。置于洁净动物房中饲养。采取自由采食、饮水的饲养方式，连续喂养28 d。

1.2.2 丹参水提取液的制备 称取丹参100 g，加入10倍体积超纯水，浸泡约30 min后于煎药壶内以大火煮沸，沸后转文火煎煮30 min，过滤药渣将药液倒出，药渣继续添加8倍体积超纯水，大火煎煮沸腾后转文火煎30 min，滤除药渣，合并2次提取药液[20]。药液先用重叠后的16层纱布过滤，后用滤纸再次过滤，最后1 000 r/min离心10 min除去药渣[21]，取上清。用旋转蒸发仪蒸发水分，使药液浓缩至100 mL，即1 g/mL丹参水提取液。分装在10 mL EP管-20 ℃保存，并于30 d内用完。

1.2.3 菌种复苏 大肠杆菌O101的冻存菌种以划线分离法将菌种接种于营养琼脂固体培养基上，扣置于37 ℃温箱培养24 h后取出观察。肉眼观察确认无杂菌后，取洁净一载玻片并在其中央滴蒸馏水，从分离培养平皿中挑单个菌落，于蒸馏水中划开。酒精灯固定玻片，温度以玻片不烫手为宜。经革兰氏染色后镜检，确认无杂菌后即可复苏。

将经纯度检测的大肠杆菌O101的菌种进行传代复苏。于灭菌试管中进行菌种复苏，将冻存菌液加入到5 mL的营养肉汤液体培养基，置于摇床上，220 r/min，温度37 ℃，培养12 h，传3代复苏至镜下观察菌形态健壮即可。

1.2.4 丹参水提取液投喂方法 用无菌生理盐水分别将1 g/mL丹参水提取液稀释为0.3900、0.1950、0.0975 g/mL，小鼠灌胃的药液现用现配。

空白组：无菌生理盐水0.2 mL/(只·d)灌胃；低剂量组、中剂量组、高剂量组丹参水提取液依次为0.3900、0.1950、0.0975 g/mL，每次灌胃剂量均为0.2 mL/(只·d)，共灌药28 d。灌胃饲养期间，均任其自由取食、饮水。饲喂期间每天观察小鼠的生理情况。试验中所用的丹参水提取液是同一批煎熬制备，灌胃配制前需摇匀，以保证每次灌胃的剂量相同。

1.2.5 小鼠生长曲线 试验开始后，每间隔6 d称量1次所有小鼠体质量，同时加深小鼠身上标记。记录每只小鼠体质量变化并绘制图表。

1.2.6 肝脏及脾脏脏器指数的测定 丹参水提取液灌胃的第7天、第14天、第21天和第28天，进行肝脏及脾脏脏器指数的测定。随机选取引颈处死3只小鼠，解剖摘取肝脏及脾脏，除去脂肪以及筋膜在电子天平上称量并记录。用器官质量与该小鼠体质量作比，为该脏器指数。

1.2.7 肠道菌群计数 本试验全程为28 d，持续用丹参水提取液灌胃28 d。于灌胃后的第7天、第14天、第21天和第28天，设空白组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。每组随机选取3只小鼠，引颈处死。无菌操作、收集盲肠于灭菌EP管，用于检测盲肠肠道中的乳酸杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌的数量。

精密称取0.1 g盲肠内容物于灭菌EP管中，剪碎内容物与生理盐水混合均匀，加入1 mL无菌生理盐水，涡旋混匀至少1 min，作为原液。以无菌生理盐水做10倍梯度稀释，稀释至10-10。

用MRS培养基筛选计数乳酸杆菌；以BP培养基筛选计数金黄色葡萄球菌；以麦康凯培养基筛选计数大肠杆菌；以SS培养基计数沙门氏菌。

采用倾注法计数：吸取0.1 mL稀释倍数为10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10的内容物混匀，分别至无菌培养基平皿，乳酸细菌培养基(MRS)、金黄色葡萄球菌的鉴别培养基(BP)、SS琼脂培养基、麦康凯培养基高压后晾温后倒入平皿，左右上下轻轻摇晃使培养基与菌液混匀。待平皿晾凉后倒置在37 ℃恒温箱培养48 h，进行细菌计数。

1.2.8 小鼠大肠杆菌O101半数致死模型试验 小鼠适应性饲喂7 d，待试验鼠适应环境后。将60只体质量35 g±2 g试验鼠分组，10只一组分6组，设为6组不同剂量的LD50大肠杆菌半数致死剂量组。采取自由采食、饮水的饲养方式。每天换水，隔天更换垫料，连续喂养28 d。

复苏经纯度检测后的大肠杆菌O101，将复苏后的大肠杆菌O101以无菌生理盐水分别稀释至所需浓度备用，6组小鼠依次腹腔注射3.503×108、2.234×108、2.987×108、2.758×108、2.545×108、2.350×108CFU/mL的大肠杆菌O101菌液，0.2 mL/只，注射后观察小鼠精神状态、被毛、饮食、排泄以及死亡情况。

1.2.9 大肠杆菌O101对小鼠的攻毒试验 在饲喂丹参水提取液28 d后，根据得到的大肠杆菌O101的半数致死剂量，对小鼠进行攻毒，每只小鼠0.2 mL/只。用小鼠的活率评价丹参水提取液对小鼠抗大肠杆菌感染的临床预防效果。

1.2.10 攻毒后小鼠肠道菌群计数 攻毒后小鼠于24 h后按1.2.7方法无菌取出盲肠段内容物进行乳酸杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的计数。

2 结果与分析

2.1 小鼠体质量的变化

饲喂丹参水提取液未对雄性小鼠体质状况产生明显影响，空白组、低剂量组、中剂量组、高剂量组未出现明显诸如活动减少、被毛凌乱等生理反应。

在灌胃丹参水提取液的过程当中，小鼠表现出精神状态良好，被毛、饮水、摄食、排泄等方面没有差异，未出现腹泻等病态状况(图1)。丹参水提取液灌服7 d时，低剂量组与空白组无差异，低剂量组有促进体质量增加趋势，而中剂量组、高剂量组与空白组比较存在差异(0.01

2.2 小鼠脾脏指数和肝脏指数的变化

丹参水提取液灌服对小鼠脾脏指数和肝脏指数的影响见图2。在灌胃丹参水提取液的过程中，小鼠表现出精神状态良好，被毛、饮水、摄食、排泄等方面，未出现腹泻等病态状况，低剂量组、中剂量组、高剂量组与空白组无差异。

丹参水提取液灌服14 d时，低剂量组、中剂量组、高剂量组与空白组的脾脏指数没有差异(P>0.05)，脾脏指数有增加的趋势，但未达到差异；丹参水提取液灌服21 d时，低剂量组与空白组脾脏指数无差异(P>0.05)；丹参水提取液灌服28 d时，低剂量组、中剂量组、高剂量组与空白组脾脏指数没有差异(P>0.05)，中剂量组、高剂量组对脾脏指数的增加效果并不明显。

丹参水提取液灌服14 d时，低剂量组、中剂量组、高剂量组与空白组的肝脏指数没有差异(P>0.05)，低剂量组、高剂量组并无增加肝脏指数的趋势；丹参水提取液灌服21 d时，低剂量组、中剂量组与空白组存在差异(0.010.05)。

小鼠在连续饲喂丹参水提取液后，低剂量组、中剂量组、高剂量组对促进小鼠脾脏指数和肝脏指数的趋势并不显著。

图2 灌服丹参水提取液对小鼠脾脏指数和肝脏指数的影响Fig.2 Feeding S. miltiorrhiza water extract to increase spleen index of mice ang feeding liver index of mice

2.3 肠道菌群变化

2.3.1 乳酸杆菌变化 灌服丹参水提取液后低剂量组、中剂量组、高剂量组小鼠盲肠内容物乳酸杆菌计数结果如图3所示，丹参水提取液灌服7 d时，低剂量组与空白组的乳酸杆菌数量无差异，中剂量组、高剂量组与空白组比较差异极显著(P<0.001)；丹参水提取液灌服14 d时，低剂量组与空白组的乳酸杆菌数量没有差异，中剂量组与空白组差异显著(0.001

图3 丹参水提取液对乳酸杆菌的增菌效果Fig.3 Lactobacillus count of cecal contents in mice fed with S. miltiorrhiza water extract

2.3.2 金黄色葡萄球菌变化 丹参水提取液灌服后的小鼠盲肠内容物金黄色葡萄球菌计数如图4所示，丹参水提取液灌服7 d时，低剂量组与空白组的金黄色葡萄球菌数量存在差异(0.010.05)，高剂量组与空白组差异极显著(P<0.001)。

图4 丹参水提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果Fig.4 Mouse cecal contents Staphylococcus aureus counted with S. miltiorrhiza water extract

2.3.3 大肠杆菌变化 丹参水提取液灌服后的小鼠盲肠内容物大肠杆菌计数如图5所示，丹参水提取液灌服7 d时，低剂量组、中剂量组、高剂量组与空白组的大肠杆菌数量无差异(P>0.05)；丹参水提取液灌服14 d时，低剂量组、高剂量组与空白组的金黄色葡萄球菌数量无差异，中剂量组与空白组差异显著(0.0010.05)，高剂量组与空白组差异极显著(P<0.001)。

图5 丹参水提取液对大肠杆菌的抑菌效果Fig.5 E. coli count of cecal contents in mice fed with S. miltiorrhiza water extract

2.4 大肠杆菌O101半数致死模型试验

大肠杆菌O101半数致死模型试验见表1。攻毒后5～6 h左右开始，有的小鼠出现被毛凌乱逆立、精神萎靡、不愿活动多蜷缩在一起、眼睑红肿多有白色分泌物流出，有些小鼠紧闭双眼、粪便稀软发黄、多数小鼠肛门附近沾有稀便。部分小鼠死亡，死亡时间集中在10～24 h，24 h后几乎无死亡情况，病态小鼠体态转好，活动范围逐渐增加，食欲渐好。通过SPSS软件，计算得出大肠杆菌O101对小鼠的半数致死量为2.758×108CFU/mL。

表1 小鼠人工感染E. coli O101 LD50测定Tab.1 KM mouse LD50 assay of E. coli O101 infected

2.5 大肠杆菌O101半数致死量攻毒试验

大肠杆菌O101半数致死量攻毒试验见表2。本试验全程为28 d，持续用丹参水提取液灌胃28 d，28 d试验结束后用复苏好的大肠杆菌O101以腹腔注射的方法进行攻毒试验，每只小鼠剂量为2.758×108CFU/mL，每只小鼠0.2 mL，注射后连续观察96 h。

空白组，在3 d内死亡6只小鼠，而其他剂量组小鼠存活数量如表2所示，死亡数量均低于空白组，从而得出，丹参水提取液对大肠杆菌O101有抑制作用。

丹参水提取液对小鼠健康未造成影响，小鼠体态和饮食正常，意味丹参水提取液成分安全，可进行饲喂试验。

2.6 攻毒后肠道菌群变化

丹参水提取液灌服28 d后的小鼠攻毒24 h后盲肠内容物乳酸杆菌计数如图6(A)所示，低剂量组、中剂量组、高剂量组与空白组差异极显著(P<0.001)。

表2 大肠杆菌O101半数致死攻毒试验Tab.2 E. coli O101 LD50 attack grouping

图6 攻毒后肠道菌群变化Fig.6 E. coli count of cecal contents in mice fed with S. miltiorrhiza water extract

丹参水提取液灌服28 d后的小鼠攻毒24 h后盲肠内容物金黄色葡萄球菌计数如图6(B)所示，低剂量组、中剂量组与空白组存在差异(0.01

丹参水提取液灌服28 d后的小鼠攻毒24 h后盲肠内容物大肠杆菌计数如图6(C)所示，低剂量组、中剂量组、高剂量组与空白组差异显著(0.001

3 讨 论

肝脏指数及脾脏指数方面，21 d时低剂量组与中剂量组的肝脏指数与空白组相比明显上升，低剂量组、中剂量组、高剂量组脾脏指数与空白组相比略有上升，说明丹参水提取液能轻微刺激小鼠免疫器官的发育，丹参水提取液可促进免疫器官发育，提高机体免疫力。

体质量增加方面，丹参水提取液灌胃后，中剂量组和高剂量组与空白组相比体质量增加明显，低剂量组存在体质量增加趋势，但与空白组比较无明显差异。丹参水提取液的饲喂可促进小鼠体质量增加。

肠道内的细菌可根据其对宿主的作用，分为三大类[22]：对机体本身有利无害的，这类菌多具有营养和免疫调节等作用，如乳酸杆菌、双岐杆菌等；对机体本身有害的，这类菌多为条件致病菌，当微生态平衡时并无害处，但在一定条件下该类菌对机体具有侵害作用，如大肠杆菌；过路菌，如金黄色葡萄球菌。Mardini等[23]研究表明益生菌在临床应用当中配合使用会加快疗效，当益生菌数量增高的同时病原菌数量在下降，证明中草药有效辅佐治疗会带来事半功倍的效果。丹参在机体内的优势作用主要体现在可以使乳酸杆菌的数量有上升的趋势，使大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌的数量有下降趋势。而沙门氏菌在本次试验的攻毒前后小鼠盲肠内容物中均未检测到，具体原因有待进一步探究。

一旦肠道内菌群出现比例失衡、数量变化，就很有可能导致肠道生物、免疫屏障遭到破坏，严重则会导致患病。通过调节肠道菌群益生菌、病原菌的数目，可以达到减少疾病发生的概率。李玉英等[24]通过试验验证饲喂一段时间中药健脾散剂的小鼠肠道大肠杆菌数量有明显下降趋势。

大量的试验证明中草药具有改善畜禽肠道内菌群的作用。丹参水提取液在体外对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长具有抑制作用，同时对小鼠体内的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有显著的抑菌作用，而对乳酸杆菌有明显的促生长作用。研究发现丹参可以在一定程度上改变机体肠道微环境，菌群结构等，从而进一步激发机体的调控机制。丹参水提取液促进乳酸杆菌的生长繁殖，而乳酸杆菌又可以通过产生营养物质，如消化酶类、维生素类等增加宿主体质量，起到促生长作用；还有抑制肠道有害菌生长的效力，Sahu等[25]的研究结果证明益生菌通过产生营养物质方式以及产生额外营养物质增加体质量，猜测丹参水提取液有促生长作用是与乳酸杆菌数目增加有一定关系。

在饲喂丹参水提取液后，小鼠的生长性能提高，有促进肝脏指数、脾脏指数的趋势，有效促进益生菌的生长、抑制病原菌，最主要的一点是减少E.coli在小鼠体内的定植。在进行大肠杆菌攻毒后，能明显降低小鼠的死亡数。证明饲喂丹参水提取液对小鼠起到保护作用。攻毒后小鼠的盲肠内容物菌群，对益生菌起到促进作用，对病原菌起到抑制的作用。