森林草莓FvM4K1基因的克隆及表达分析

谷 思，曹小艳，邢 宇

(北京农学院植物科学技术学院/北京林果业生态功能提升协同创新中心/农业应用新技术北京市重点实验室，北京 102206)

草莓(Fragariaananassa)是蔷薇科草莓属重要的多年生草本植物，因其营养成分丰富，味道甜美而深受人们喜爱。另外，森林草莓(Fragariavesca,‘Hawaii 4’)作为草莓属重要的二倍体资源，具有遗传背景简单，生命周期短等特点，其基因组测序已经完成，因此，森林草莓成为蔷薇科植物基因组研究和基因功能验证的模式植物之一[1-3]。

促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)在动植物中是一类高度保守的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶[4]。在许多信号转导中起着调控作用，具体调控方式是首先MAP4K被激活，继而通过磷酸化激活MAP3K，以此类推MAP2K和MAPK也被激活，这样信号就被逐级放大[5]。在模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)中，已被鉴定了20个MAPK，10个MAPKK[6]；比如，MAPK6受到环境因素的诱导，并参与生殖器官的生长发育[7-9]及光的形态建成[10]等。

植物生长发育的各个阶段都离不开植物激素的调控，而生长素作(IAA)为五大激素之一，是发现最早、研究最多、普遍存在的一种激素[11]，其重要的调控作用体现在促进器官的发生和生长。比如，影响叶片的发育及形态建成[12]，介导生殖器官的生长[13]，促进果实的发育，特别是胚的形成。植物的逆境反应与生长素相关[14]。在拟南芥和水稻中的研究表明MAPK参与生长素的信号转导[5,8]。当生长素受体识别结合生长素后，将信号传至细胞内，激活细胞内的第二信使，目前研究较多的是两种传导途径，分别为依赖于磷脂酶A2(PLA2)的传导途径和不依赖于磷脂酶A2的传导途径，其下游组分可能包括蛋白激酶MAPK。最近的研究表明MAPKK7-MAPK6还调控下游的生长素极性运输基因PIN[15]。

北京农学院农业应用新技术北京市重点实验室已经对森林草莓MAPK信号传递链的各个成分进行鉴别与分析，得到12个MAPK，7个MAP2K，73个MAP3K和1个MAP4K[16]，其中位于信号链最上游的MAP4K被关注。本研究克隆FvM4K1的CDS区，并通过生物信息学软件分析该基因的保守结构域，核定位序列以及蛋白性质。进一步利用荧光定量PCR技术对FvM4K1在森林草莓不同器官中的表达量进行分析，并对外源激素生长素处理不同时间的FvMP4K的表达量变化进行研究，为进一步探究该基因在草莓生长发育过程中的功能提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与激素处理

试验材料为生长在温度为22 ℃±1 ℃，光照/黑暗为11 h/13 h培养室的二倍体森林草莓‘Hawaii 4’(Fragariavesca)。

配制浓度为1 μmol/L的生长素(sigma, USA)，生长素粉末先用75% 酒精溶解再用纯水定容，注意避光保存。选用森林草莓‘Hawaii 4’的种子为材料，消毒后在MS培养基上生长至2片真叶时，移至MS+1 μmol/L生长素的培养基处理，处理后按照0、1、3、5、7、9 d取样。

1.2 试验方法

1.2.1FvM4K1的克隆 将收集到的森林草莓‘Hawaii 4’各个器官的样品，用研钵在液氮中充分研磨，利用plant RNA kit (Omega, USA)提取总RNA，然后将纯化后的RNA用Prime ScriptTMDouble strand cDNA Synthesis Kit(Takara, China)逆转录得到cDNA，保存于-20 ℃冰箱。根据文献[16]，在森林草莓‘Hawaii 4’的MAPK级联放大信号通路中鉴别出一个最靠上游的激酶FvM4K1。根据该基因的CDS区，利用Oligo 7.57设计引物，正向引物序列为5′-ATGGCTTTCTTATTCTTCCT-3′，反向引物序列为5′-CTACAAACGAAGAATGGTTCTTA-3′ 。引物合成后，进行PCR反应，采用Q5 High-Fidelity DNA Polymerase(NEB)，50 μL扩增体系是Q5 DNA聚合酶0.5 μL，5×Q5聚合酶缓冲液10 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，10 μmol/L前后引物共5 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 31.5 μL，反应条件为98 ℃预变性30 s，98 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min 30 s，循环数为34。然后利用1%琼脂糖凝胶电泳检测，得到相应的目的片段后，采用胶回收试剂盒(Axygen, USA)切胶回收目的片段，之后将回收的目的片段与pGEM©-T EASY(promega, USA)连接，转化大肠杆菌DH5α，涂板，37 ℃过夜培养，经蓝白斑筛选后，挑菌，进行菌落PCR，挑选阳性菌送测序(北京六合华大科技有限公司完成)。

1.2.2FvM4K1生物信息学分析 利用DNAMAN 5.2.2对FvM4K1的氨基酸序列进行分析，通过ExPASy对其编码的蛋白进行理化性质的分析，再在NCBI Conserved domain search分析该基因的保守结构域，然后利用NLS mapper进行该基因的核定位序列，通过ClustalX进行多序列比对，最后，利用MEGA-X 5构建进化树。

1.2.3FvM4K1实时荧光定量PCR 首先，将生长素处理后的样品同1.2.2的操作得到cDNA，然后利用Beacon Designer 7.9设计荧光引物，正向引物为5′-GGCTTTCTTATTCTTCCTCTTTA-3′，反向引物为5′-TCCGTTGGTGACTTGG-3′。经鉴定该荧光引物可用，然后内参基因选为Fvactin，选用SYBR Green Ⅱ(Takara, China)，3次重复，反应体系与程序依据说明书，由Light Cycler©96 SW1.1 Real-Time PCR System来分析。

2 结果与分析

2.1 FvM4K1基因的克隆

以森林草莓‘Hawaii 4’各个器官cDNA混合样品为模板，对FvM4K1基因进行克隆。 PCR扩增得到目的条带(图1)，其片段大小与目的片段相符合，然后切胶回收，连接到克隆载体pGEM-T EASY，经转化涂板，菌落PCR后，将阳性菌落送去测序，用NCBI进行序列比对，发现测序结果与基因组核酸序列基本吻合，相似度为99.8%，测序结果的氨基酸序列与基因组氨基酸序列完全吻合，相似度为100%。

注：M是DL5000；1-4为FvM4K1扩增产物。Note：M is DL5000；1-4 are FvM4K1 PCR products.图1 FvM4K1基因扩增Fig.1 The PCR productof FvM4K1 genes

成功克隆FvM4K1，开放阅读框2 466 bp，编码821个氨基酸。

2.2 FvM4K1基因的生物学分析

首先，利用DNAMAN 5.2.2分析得到，FvM4K1开放阅读框为2 466 bp，编码821氨基酸。再利用ExPASy-ProtParam分析，其编码蛋白的蛋白相对分子量为90.2 kD，理论等电点(pI)为5.21，脂肪族氨基酸指数为71.06，亲水平均系数(GRAVY)为-0.543。然后，利用NCBI Conserved domain search分析发现其功能域为位于第239个氨基酸到第494个氨基酸的激酶结构域，属于类PKc亚家族。利用NLS mapper预测到该基因的核定位序列为FVYKNNAHDDDDDDDDDDDASLPPLLKRLPK，位于第73到第103个氨基酸。

以模式植物拟南芥为外参，利用ClustalX软件对蔷薇科不同属的植物进行激酶结构域序列同源性的分析。丝氨酸/苏氨酸激酶结构域在植物中非常保守，尤其是同科内同源性更高(图2)。依据氨基酸序列开展进化树分析，森林草莓FvM4K1与月季亲缘关系最近，且聚在同一分支上，蔷薇科的其他几个属在另一分支上，与森林草莓FvM4K1亲缘关系较近，但拟南芥在单独的一支上，表明该基因存在明显的种属差异(图3)。

图2 不同植物激酶区同源序列比对Fig.2 Homologous sequence alignment of kinase domain in different plants

图3 根据氨基酸序列聚类的M4K1基因的进化树Fig.3 Phylogenetic tree based on amino acid sequence among plant M4K1

2.3 FvM4K1基因的表达分析

利用qRT-PCR对FvM4K1基因在森林草莓‘Hawaii 4’各个器官中的相对表达量进行测定。该基因在森林草莓的各个器官中均有表达，在根和茎中表达量相对较低，且在叶片，花朵和果实中的表达量较高，值得注意的是在叶片中的表达量最高(图4)。

1 μmol/L生长素处理后，FvM4K1在叶片中的表达量随时间的推移先上升后下降至初始水平，且在处理7 d后表达量达到最高，约为处理前的8倍(图5)，由此，推测FvM4K1可能响应生长素，并参与植物生长发育的调控。

注：大写字母表示差异极显著Note：capital letters indicate extremely significant differences图4 FvM4K1在‘Hawaii 4’不同器官中的相对表达量Fig.4 The relative expression of FvM4K1 in the different organs of ‘Hawaii 4’

3 讨 论

草莓属植物在中国广泛分布，其栽培面积和产量均居世界第一，草莓的产量，品质与自身生长发育有着密切的联系。由于生长素对草莓生长发育起着至关重要的作用，一方面，生长素促进草莓果实的生长发育，另一方面，当生长素含量过高时，会影响草莓的花芽分化，形成畸形果，鸡冠果或双身果等[17-19]。另外，MAPK在响应生长素方面发挥重要的作用。相关研究已表明，MAPK响应环境中生长素的刺激，快速传递信号同时放大信号，进而调节草莓的生长发育。本研究从生长素和激酶入手研究FvM4K1对草莓生长发育的作用。

注：大写字母表示差异极显著，小写字母表示差异显著。Note：capital letters indicate extremely significant differences, small letters indicate significant differences图5 FvM4K1在1 μmol/L 生长素处理后不同时间的相对表达量Fig.5 The relative expression of FvM4K1 after treatment of 1 μmol/L IAA

本研究克隆得到森林草莓FvM4K1，该基因全长2 466 bp，编码821个氨基酸。生物信息学分析可知，其含有一个激酶结构域和NLS核定位序列，由此，可以推测其亚细胞定位的结果，为蛋白互作的位置提供方向，从而探究激酶在信号传递和草莓生长发育中的作用。同源序列比对和进化树分析表明，森林草莓FvM4K1与月季同源基因同源关系较近，而与同科植物相比森林草莓与拟南芥距离较远，但由于整个遗传距离很小且激酶结构域保守，所以拟南芥也可以为该基因之后的功能研究提供线索。组织特异性表达分析揭示了FvM4K1基因在草莓的根、茎、叶片、花朵、果实中皆有表达，但是表达量有着显著的差异。尤其是其在叶片，花朵、果实中相对较高的表达量，暗示草莓FvM4K1基因在草莓生长发育过程中，特别是果实发育过程中可能发挥着重要的调控作用。外源激素生长素处理草莓实生苗后，FvM4K1在生长素处理后迅速响应，呈现先上调后下降至初始水平的表达趋势，并在生长素处理7 d后达到顶峰，表明FvM4K1可能在生长素信号传导中发挥一定的作用。这与前人研究的激酶响应生长素，参与信号调控相一致[5]。将借助遗传证据来直接验证草莓FvM4K1基因对草莓生长发育的功能，并利用分子手段解析生长素调控草莓生长发育的机理，为草莓优良品种的培育提供理论基础。