蒜氨酸对血管性痴呆大鼠脑损伤的作用及机制研究

刘 景 张月月

1 惠州市第一人民医院药学部(惠州 516000) 2 遵义医科大学珠海校区(珠海 519000)

血管性痴呆(Vascular dementia, VD)是由各种脑血管疾病引起的以认知功能障碍为表现的一种临床综合症。近年来，VD发病率逐年上升，仅次于阿尔茨海默病成为世界上第二大痴呆常见类型[1]。目前，对于VD治疗尚无特效药。蒜氨酸是大蒜中的主要有效成分，化学名为S-烯丙基半胱氨酸亚砜(SAC)，赵立、HUI等[2- 3]研究发现蒜氨酸具有抗氧化、清除自由基、抗炎症及保护心血管等多种作用。本研究主要观察蒜氨酸对血管性痴呆(VD)脑损伤的作用，并探讨其可能的作用机制，为其应用于临床提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

动物：SD(Sprague-Dawley)大鼠，雌雄各半，体质量在200～250 g，购自第三军医大学大坪医院实验动物中心，许可证号为SCXK(渝)2016-5。所有大鼠均遵循实验动物伦理学要求进行饲养及实验操作。

试剂：蒜氨酸(本实验室自己提取，纯度大于94%)，超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(英国Abcam公司)，iNOS兔抗大鼠多克隆抗体(英国Abcam公司)，IL-1β兔抗大鼠多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，TNF-α兔抗大鼠多克隆抗体(武汉BOSTER公司)，β-actin小鼠抗大鼠多克隆抗体(江苏碧云天生物技术研究所)。

主要仪器：MT- 200 Morris水迷宫购自成都泰盟科技有限公司，i-mark酶标仪及全自动凝胶图象分析仪均购自美国BIO-RAD公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分组、造模与给药方法

采用随机数字表法将40只大鼠分为假手术组、模型组、蒜氨酸低、中、高剂量组，每组大鼠为8只。模型组和蒜氨酸组采用双侧颈总动脉结扎建立VD大鼠模型，具体方法如下：造模前12 h每组大鼠开始禁食，正常饮水，各组大鼠用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射进行麻醉，麻醉成功后立即分离迷走神经及颈总动脉，用双重丝线结扎双侧颈总动脉。假手术组只分离颈总动脉，但不做结扎。造模7 d后蒜氨酸组分别给予蒜氨酸10、20、30 mg/kg灌胃治疗，假手术组和模型组给予等量生理盐水灌胃治疗，每组均为1次/d，共4周。

1.2.2 Morris水迷宫行为检测

各组动物灌胃4周后，进行Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力。水池直径140 cm，高40 cm，水深35 cm，水温(24±2)℃。在目标象限中放置一个平台，直径11 cm，高26 cm，没于水下1 cm。实验总共6天，前5天进行定位航行实验，每天训练4次，每次入水点可以不同，平台位置不变，每次记录大鼠寻找到平台的时间。第6天进行空间探索实验，撤去平台，记录60s内找到平台次数。

1.2.3 大鼠海马组织SOD活性检测

水迷宫实验后，各组大鼠随机选取4只用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射进行麻醉，麻醉后断头取脑，分离海马组织，加入裂解液进行匀浆，然后离心取上清液。采用ELISA法检测大鼠海马超氧化物歧化酶(SOD)活性，所有操作步骤均严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.4 Western blotting检测大鼠海马iNOS、IL-1β及TNF-α蛋白的表达

水迷宫实验后，各组大鼠的另外4只用水合氯醛(3 mL/kg)麻醉后，断头取脑，分离海马组织，匀浆，4℃，12 000 rpm，离心10 min，然后取上清液，用BCA法测定待测样品的蛋白浓度。配胶、上样，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离蛋白，然后将分离的蛋白转移到PVDF膜上。将一抗加入装有PVDF膜的塑料膜袋中，4℃孵育过夜，取出在室温加入二抗孵育90 min。然后使用ECL化学发光法用BIO-RAD凝胶成像仪进行曝光，后将胶片进行扫描，采用Quantity One定量分析软件系统对图像进行灰度分析。

1.2.5 统计学处理

2 结 果

2.1 蒜氨酸对血管性痴呆大鼠学习记忆的影响

Morris水迷宫结果表明，与假手术组比较，模型组在定位航行实验中逃避潜伏期延长(P<0.05)，在空间探索实验中找到平台次数也减少(P<0.05)。蒜氨酸各剂量组与模型组比较逃避潜伏期缩短(P<0.05)，找到平台次数增加(P<0.05)。第一天假手术组与模型组比较P=0.015，F=7.706；第二天假手术组与模型组比较P=0.004，F=11.767；第三天假手术组与模型组比较P=0.021，F=6.792；第四天假手术组与模型组比较P=0.006，F=10.551；第五天假手术组与模型组比较P<0.001，F=22.379；第六天假手术组与模型组空间探索实验比较P=0.001，Z=- 3.371；第一天蒜氨酸高剂量组与模型组比较P=0.034，F=5.553；第二天蒜氨酸高剂量组与模型组比较P=0.012，F=8.239；第三天蒜氨酸高剂量组与模型组比较P=0.037，F=5.342；第四天蒜氨酸高剂量组与模型组比较P=0.022，F=6.667；第五天蒜氨酸高剂量组组与模型组比较P=0.003，F=12.389；第六天蒜氨酸高剂量组与模型组空间探索实验比较P=0.001，Z=- 3.184；第一天蒜氨酸中剂量组与模型组比较P=0.048，F=4.682；第二天蒜氨酸中剂量组与模型组比较P=0.041，F=5.084；第三天蒜氨酸中剂量组与模型组比较P=0.047，F=4.738；第五天蒜氨酸中剂量组组与模型组比较P=0.033，F=5.608；第六天蒜氨酸中剂量组与模型组空间探索实验比较P=0.008，Z=- 2.659；第六天蒜氨酸低剂量组与模型组空间探索实验比较P=0.008，Z=- 2.659。见表1。

表1水迷宫测试蒜氨酸对血管性痴呆大鼠学习记忆的影响

注：*P<0.05与模型组比较；#P<0.05， 与假手术组比较

2.2 蒜氨酸对血管性痴呆大鼠海马SOD含量的影响

与假手术组比较，模型组大鼠海马SOD含量下降，差异有统计学意义(P<0.001，F=127.608)；蒜氨酸高剂量组与模型组比较，大鼠海马SOD含量升高，差异有统计学意义(P<0.001，F=67.5)；蒜氨酸中剂量组与模型组比较，大鼠海马SOD含量升高，差异有统计学意义(P<0.001，F=47.44)；蒜氨酸低剂量组与模型组比较，大鼠海马SOD含量升高，差异有统计学意义(P=0.047，F=6.237)。见表2。

组别SOD(U/mg)假手术组8.76±0.053模型组3.75±1.23##蒜氨酸低剂量组4.48±1.10*蒜氨酸中剂量组6.15±1.27**蒜氨酸高剂量组6.65±0.95**

注：**P<0.01 与模型组比较；*P<0.05 与模型组比较；##P<0.01 与假手术组比较

图1 蒜氨酸对iNOS、IL-1β及TNF-α蛋白表达的影响

2.3 蒜氨酸对大鼠海马iNOS、IL-1β及TNF-α蛋白表达的影响

采用Western blotting检测了大鼠海马iNOS、IL-1β及TNF-α的蛋白表达。结果显示：与假手术组比较，模型组iNOS、IL-1β及TNF-α蛋白表达升高；蒜氨酸各剂量组与模型组比较，iNOS、IL-1β及TNF-α蛋白的表达降低(P<0.05)(见图1)。

3 讨 论

血管性痴呆(Vascular dementia, VD)的发病机制至今尚未完全明确，但多数学者认为氧化应激和炎症反应是VD发病的不可忽视的重要环节[4- 5]。VD患者血液中氧自由基如NO、iNOS等增多，而相应的氧化应激标志物SOD等体内清除自由基的关键酶减少。Zhang等[6]研究发现VD大鼠海马组织内 TNF-α 和 IL-1水平增高，且神经元形态异常，认知能力下降，且有研究报道，VD患者脑内iNOS、IL-1β及TNF-α水平高于非VD患者[7]。Luo等[8]发现抑制VD大鼠海马区小胶质细胞活化，能使iNOS、IL-1及TNF-α 降低，并能减轻海马神经元损伤。由上可提示，炎症相关因子增多可能会引起神经元损伤或死亡， 进一步影响认知功能，最终导致VD的发生。

蒜氨酸是大蒜中的主要有效成分，化学名为S-烯丙基半胱氨酸亚砜(SAC)。有研究报道，蒜氨酸具有抗炎、抗氧化及清除自由基等作用[2- 3]，本研究主要是观察蒜氨酸对VD大鼠脑损伤的作用及其可能的作用机制。在Morris水迷宫实验中发现蒜氨酸给药组的大鼠在定位航行实验中逃避潜伏期缩短，空间探索时寻找到平台次数增加，提示蒜氨酸可改善VD大鼠学习记忆能力。

氧化应激在VD的发生发展中起重要的作用，当大脑发生缺血性损伤时，NO和 iNOS 急剧增加，NO具有潜在的神经毒性，可通过与氧自由基相互反应生成有毒性的强氧化剂，最终导致神经元坏死或凋亡[9]。iNOS是NO生成过程中重要的限速酶，能够持续催化NO产生，其过度表达会促进神经元进一步的损伤[10]。SOD是清除氧自由基的重要的超氧化物歧化酶，可以减少氧化应激损伤，因此它在大脑损伤时会因消耗增加而活力下降。本研究发现模型组大鼠海马SOD含量下降，iNOS蛋白表达增高，而蒜氨酸给药组与模型组比较，大鼠海马SOD含量升高，iNOS蛋白表达下降，提示蒜氨酸可能通过调节自由基代谢，提高抗氧化剂活力，降低炎症相关酶类的表达，从而减轻脑神经损伤。

有研究[11-12]显示，炎症在VD发生发展过程中起重要作用。炎症可刺激小胶质细胞使其活化后分泌大量IL-1β、TNF-α等引起神经元损伤，IL-1β、TNF-α等升高可损害认知功能[13]，进一步导致VD的发生。TNF-α能使细胞黏附分子ICAM-1、VCAM-1等增加，从而破坏血脑屏障的功能[14]。另外促炎因子IL-1β及TNF-α等还可促使神经细胞产生iNOS，进一步加重神经元损害。有报道[15]显示IL-1β及TNF-α等促炎因子可能通过直接损害胆碱能细胞而导致Ach合成减少，从而破坏胆碱能系统，最终导致VD的发生。本研究显示模型组IL-1β及TNF-α蛋白表达升高，蒜氨酸给药组与模型组比较，IL-1β及TNF-α蛋白的表达降低，提示蒜氨酸可能通过抑制IL-1β及TNF-α炎症因子的产生，从而减轻脑组织损伤。VD的发生发展机制相当复杂，蒜氨酸对于VD的治疗作用仍有待进一步研究。