灵芝孢子粉对中重度慢性阻塞性肺疾病的随访研究

冼慧仪 冯曙平 陈 艳 吴 凡 李风雷

广州医科大学附属第三医院荔湾医院(广州 510000)

慢性阻塞性肺病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种持续进展性的气道疾病，特征为广泛气流受限和气道炎症。COPD在中国的发病率逐年上升， 40岁以上人群的发病率由8.2%上升至13.7%[1- 2]。COPD疾病死亡率在世界疾病和死亡原因中排名第四，预计将在2020年升至第三大死亡原因[3]。该病的病因和发病机制尚不清楚。慢性气道炎症被认为是COPD发病机制中最重要的组成部分[4]。COPD的另一个病理特征是气道黏膜和肺实质中的T淋巴细胞浸润[5], 肺泡壁T细胞数量与肺组织损伤程度呈显著正相关。COPD小鼠模型显示肺实质中T细胞数量增加，且以CD8+T以及CD4+T 为主[6]。

灵芝包含400多种不同的生物活性化合物，其中主要有三萜、糖类(多聚糖和还原糖)、麦角甾醇类、类固醇、核酸类、脂肪酸、苯甲酸、生物碱、真菌溶菌酶、蛋白类化合物和微量元素等[7- 8]。灵芝孢子粉是灵芝的重要生物活性物质，具有调节血糖与血脂代谢、抑制肿瘤生长、提高免疫功能、减少肝损害、清除自由基、提高机体耐缺氧能力、保护心肌细胞和改善中枢神经系统等作用。T淋巴细胞是免疫执行功能中的主要炎症细胞，巨噬细胞递呈抗原后活化并发挥一系列作用。成熟的T淋巴细胞按照CD表型不同分为CD4+、CD8+两大亚群。T细胞是体内发挥免疫作用的重要细胞，是机体免疫功能的承担者和免疫反应的重要调节者，CD4+和CD8+淋巴细胞比例与气道炎症反应有着密切关系[9]。研究表明，与健康对照组比较，COPD患者的CD4+/CD8+水平与肺功能呈负相关[10]，T细胞亚群的失衡是导致COPD患者肺功能下降的原因之一[11]。COPD患者小气道管壁、血管壁和肺实质中存在大量的CD8+T细胞数量的增多，并且发现CD4+/CD8+比例失调，CD4+/CD8+比例降低与COPD患者的肺功能下降密切相关[12- 13]。呼吸气流受限程度及肺气肿炎症的严重程度与肺组织中CD8+T细胞的水平呈正相关，COPD的发病与机体免疫功能失衡存在联系[14]。COPD中的慢性气道炎症伴随着CD4+T细胞的表达降低，并且宿主识别外源性抗原的能力被削弱。这发生在长期升高的CD8+T细胞水平的背景下，降低了对肺组织的过度免疫损伤的修复能力。研究表明COPD小鼠中出现CD8+T细胞增加和CD4+T细胞的相应减少[15]。本研究中，旨在观察灵芝孢子粉在中重度稳定期COPD患者症状评分，肺功能以及对患者外周血T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+水平的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

招募2017年7月—2018年2月收治的老年中重度COPD稳定期患者共19例，其中18例男性，1例女性；年龄57～76(68.2±6.0)岁。从不吸烟12人(63.2%)，目前吸烟6人(31.6%)，已戒烟1人(5.2%)。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：①患者经影像学、临床接触、肺功能检查等明确诊断为COPD，且病情相对稳定，符合《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》(2013年修订版)制定的COPD诊断标准[1]；②临床资料完整，且认知、沟通能力正常；③患者及家属均签订了知情同意书。排除标准：①参与本研究前2个月内有过不稳定心绞痛、急性心肌梗死发作者；②合并气胸、肺大疱以及行动障碍者，或无法完成肺功能检测、6 MWT试验者；③合并肺癌等呼吸系统疾病、血液系统疾病者；④精神病等特征人群。本研究通过伦理委员会批准。

1.3 研究方法

六分钟步行试验(6 MWT)[16]：指导患者以最快速的速度在30 m长的走廊上往返行走，一旦有明显的胸闷头晕、呼吸困难等症状，则立即停止实验，并在实验结束后检测、记录患者6 min内的步行距离；其中6 MWT试验的分级标准如下：①轻度慢阻肺患者6 MWT试验距离在350 m及以上；②中度慢阻肺患者6 MWT试验距离在250～349 m；③重度慢阻肺患者6 MWT试验距离是150～249 m；④极重度慢阻肺患者6 MWT试验距离在149 m及以下。COPD评估测试(CAT)[17]：CAT测试方法主要用于评估慢阻肺对于患者生理健康的影响，包括有无胸闷、咳嗽、咳痰、气喘等项目，每个项目评分在0～5分，总分是40分，其中轻度症状者评分是0～10分，中度症状者评分是11～20分，重度症状者评分是21～30分，极重度症状者评分是31～40分。⑤肺功能检测：应用肺功能检测仪，检验患者第一秒用力呼气容积(FEV1)、用力肺活量(FVC)、第一秒用力呼气容积占用力肺活量比值(FEV1/FVC)。

1.3.1 ①服用灵芝孢子粉胶囊(北京华恒汉方制药有限公司)，3粒/次，每天3次；②比较本研究患者服用灵芝孢子粉前、后的6 MWT试验的距离、CAT测试结果以及肺功能检测指标；③应用流式细胞学检测方法，评估CD4+、CD8+T所占外周血淋巴细胞比例及CD4+/CD8+比值检测指标。

1.3.2 流式细胞学：仪器与试剂真空采血管为BD真空采血管内，内含EDTA-K2抗凝剂。淋巴细胞亚群:使用BD公司和Ebiolegned公司的抗体及BD公司鞘液进行检测。抗体及标记荧光素分别为: CD4 FITC(BD公司)，CD8 APC-H7(BD公司)。仪器使用BD LSRFortessa流式细胞仪，检测CD4+、CD8+细胞因子占外周血淋巴细胞中的比例以及CD4+/CD8+比值检测。

1.4 统计学方法

2 结 果

纳入患者的平均年龄为(68.20±6.0)岁，其中男性患者为18人(94.7%)，其中从不吸烟人数12人(63.2%)，正在吸烟人数6(31.6%)人，已戒烟人数1人(5.2%)；入选的患者肺功能均为GOLD分级3到4级。与服用灵芝孢子粉之前相比，服用灵芝孢子粉后患者的FEV1上升，在6个月时，灵芝孢子粉使用前后FEV1差异为 60 mL(图1A)，但差异无统计学意义(1.17±0.25 vs 1.23±0.27，P=0.1888>0.05)；FVC差异为130 mL(图1B)，FVC上升(2.32±0.52 vs 2.45±0.57，P=0.34<0.05)；FEV1/FVC差异为- 0.47(图1C)，FEV1/FVC未见差异(51.78±10.92 vs 51.31±10.03，P=0.7707>0.05)。服用灵芝孢子粉后第2个月开始，患者FEV1、FVC和FEV1/FVC随时间的变化呈平稳增加状态(图1D、图1E、图1F)。服用灵芝孢子粉6个月后患者的六分钟步行距离延长，平均增加19 m(服药后：490.89±35.85 vs 服药前471.32±36.07，P<0.001)，患者的CAT评分也改善(服药前12.3±3.5 vs 服药后10.8±2.4，P<0.001)，但患者的mMRC呼吸困难等级评分无差异(0.8±0.7 vs 0.8±0.6，P=0.67>0.05)。见表1、图2。

中重度COPD稳定期患者，服用灵芝孢子粉6个月后CD4+T细胞比例增加(服药前21.25±8.41 vs 服药后33.70±7.66，P=0.19<0.01)，CD8+T细胞比例有升高趋势，但差异无统计学意义(服药前19.66±8.90 vs 服药后21.25±8.41，P=0.21>0.05)，但这提示灵芝孢子粉可提高中重度COPD稳定期患者CD4+T细胞比例。CD4+/CD8+T细胞比例无明显变化(服药前1.98±0.97 vs 服药后1.87±0.91，P=0.58>0.05)。见图3及表2。

图1 服用灵芝孢子粉前、后患者FEV1、FVC和FEV1/FVC的变化。

表1肺功能指标和COPD评估指标

图2 服用灵芝孢子粉前、后患者6分钟步行试验(6 minutes walking test，6 MWT)的变化(n=19)。

图3 服用灵芝孢子粉前/后CD4+，CD8+以及CD4+/CD8+比值的变化情况(n=19)。A：CD4+T淋巴细胞亚群的散点图；B：CD8+T淋巴细胞亚群散点图；C：CD4+/CD8+比值散点图。

表2 服用灵芝孢子粉前外周血T淋巴细胞亚群的变化情况(n=19)

3 讨 论

COPD以不完全可逆性气流受限为特征性疾病变，且气流受限呈持续性发展，其病理改变表现为慢性支气管炎和(或)阻塞性肺气肿的病理变化。目前，COPD稳定期的治疗方案主要包括戒烟、药物治疗、手术治疗、机械通气等。其中治疗药物主要包括支气管扩张剂、吸入/口服糖皮质激素、炎症介质拮抗剂及抗氧化剂等[18]。慢性吸入有毒颗粒和气体会导致肺实质破坏，激活上皮细胞，增加黏液产生并刺激许多炎症细胞的迁移[19]。这导致小气道和肺泡中的异常炎症反应，其中涉及许多炎性细胞，包括中性粒细胞，巨噬细胞和T淋巴细胞[20]。

近几年来，伴随国内人口老龄化加快，加上空气雾霾等环境因素影响，COPD发生率、死亡率均呈现出升高趋势，对患者生活质量造成不良影响，并带来沉重的精神压力和医疗负担。研究表明，灵芝孢子粉可通过提高巨噬细胞产生肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)和促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)的水平调节机体免疫的功能[21]。灵芝孢子粉能够增强小鼠脾淋巴细胞的增殖能力，提高小鼠血清溶血素水平[22]，并且发现灵芝孢子油对免疫低下小鼠的固有免疫和非特异性免疫功能具有显著调节作用[23]。灵芝孢子粉可提高外周血CD4+细胞、减少外周血CD8+细胞数量，升高CD4+/CD8+比例，并且增加外周血NK细胞数量，提示灵芝孢子粉能够改善机体的细胞免疫功能[24]，我们的实验结果也发现了类似的结果。

本研究结果发现，在服用灵芝孢子粉6个月后，中重度稳定期COPD患者服用灵芝孢子粉后FEV1较服用前增加60 mL(P>0.05)(图A)，FVC增加为130 mL(P<0.01)(图B)，FEV1/FVC比例降低0.47(P>0.05)(图C)，说明患者的肺功能未见明显下降，且较服药前有轻度改善。服用灵芝孢子粉后患者FEV1、FVC和FEV1/FVC随时间的变化呈平稳增加状态，提示服用灵芝孢子粉在中重度稳定期COPD患者的肺功能存在一定的保护作用。6分钟步行距离较服药前增加19 m(P<0.001)，说明灵芝孢子粉对中、重度COPD稳定期患者治疗干预的疗效有所改善。

在COPD的发病机理中鉴定了不同的T细胞亚群，气道和肺实质中CD8+T细胞比CD4+T细胞在疾病进展过程中起到更为重要的作用[25]。COPD的许多研究都集中在免疫系统在肺部的作用。显示T淋巴细胞广泛存在于COPD患者的肺泡壁中，并且肺内淋巴细胞浸润的程度与疾病严重程度相关[26]。长期以来已经确定CD8+细胞在COPD的病原体中起主要作用，并且这些细胞大量存在于患者的气道中[27]。然而，与肺部炎症成分相比，对COPD中循环淋巴细胞的特征和功能知之甚少。我们的研究结果发现，服用灵芝孢子粉6个月后，中重度COPD稳定期患者CD4+T细胞比例显著增加(P<0.01)，CD8+T细胞比例无明显变化(P>0.05)，CD4+/CD8+T细胞比例无明显变化(P>0.05)，表明服药后患者的免疫调节状态良好，未出现明显的T细胞亚群比例改变。

本研究也存在以下不足：①观察周期较短：本研究的随访周期只有6个月，对于其用药后远期表现未做观察；②样本量不足：某些观察指标会由于样本量的不足导致统计学上的强度不够。

总之，我们的研究提供了灵芝孢子粉对稳定期COPD患者的在CAT评分及6 MWT步行距离上起着保护作用，这对于缓解中重度COPD患者的症状提供了非常重要的干预方式，为后续预防肺功能下降和改善稳定期COPD生活质量提供良好的研究基础。