融合基因阳性急性B淋巴细胞白血病患儿免疫表型分析

张 霞 刘新刚 徐 刚 覃文琪 李阿丽 郑卫东

1 深圳大学总医院检验科(深圳 518055) 2 深圳市儿童医院检验科(深圳 518000)

急性B淋巴细胞白血病(acute B-lymphoblastic leukemia，B-ALL)发病率约占急性淋巴细胞白血病的85%，是儿童时期最为常见的肿瘤[1- 2]。B-ALL的诊疗有赖于MICM的分型(即细胞形态学、免疫学、细胞遗传学和分子生物学)。在免疫学方面，恶性肿瘤细胞抗原的表达具有高度的异质性，其诊断依赖于白血病相关免疫表型[3]；在细胞遗传学及分子生物学方面，白血病存在着染色体数目及结构异常，可产生新的融合基因。表达融合基因的B-ALL是否存在特征性的免疫表型的改变并不清楚。本研究通过分析常见融合基因阳性的B-ALL患儿免疫表型特征，探讨融合基因的表达与免疫表型之间的关系，有助于提高融合基因结果判读的准确率及进一步研究B-ALL的发病机制。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集2016年10月—2018年12月在深圳市儿童医院诊断及治疗的B-ALL患儿共120例。所有患者均依据MICM标准(即具备细胞形态学、免疫分型、细胞遗传学及分子生物学结果)明确诊断[4]。患儿初诊时均应用流式细胞术分析免疫表型特性及多重巢式RT-PCR检测融合基因表达。本研究已通过医学伦理委员会批准，得到患儿及家属同意。

1.2 流式细胞术检测

采用肝素抗凝管抽取患者2～4 mL骨髓标本，24 h检测。骨髓标本通过细胞计数后，取(1～2)×105个有核细胞于流式测定管中。所用的单克隆抗体包括BD Horizon V500标记的CD45、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、别藻青蛋白(allophycocyanin，APC)、藻红蛋白(phycoerythrin，PE)、多甲藻叶绿素蛋白(peridinin chlorophyll protein，Percp)、PerCP-Cy5.5、PE-CY7、APC-Cy7、BD Horizon V450标记的淋系相关抗原(CD19、CD10、CD20、CD22、CD9、CyCD79a、CD58、SmIgM、CyIgM、TdT、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CyCD3)，髓系及干/祖细胞系相关抗原(CD13、CD64、CD14、CD15、CD33、CD117、CD11b、CD34、CD38、HLA-DR、CD123)及同型对照IgG等。以上抗体购自美国Becton Dickinson公司及Beckman Coulter公司。流式管中加入抗凝标本后根据试剂说明书加入抗体，充分混匀后，室温(18℃～25℃)下避光孵育15 min；加入溶血素充分混匀，避光放置10 min，1 300 r/min离心5 min，弃去上清液；加入磷酸盐缓冲液(PBS)充分混匀，以300 g离心5 min，弃去上清液；加入500 μL PBS混匀后用FACS Canto II流式细胞分析仪(BD公司，美国)进行检测。应用FACS Diva Version 7.0软件进行样本分析。初诊时免疫分型至少记录1×104个有核细胞。胞浆或胞核抗原表达阳性率≥10%为阳性，其他抗原表达阳性率≥20%定义为阳性。

1.3 43种融合基因检测

采用EDTA-K2抗凝管抽取患者2～4 mL骨髓标本，分离患者骨髓的单个核细胞，应用Trizol Reagent提取总RNA，并通过微量紫外分光光度仪测定RNA浓度及纯度。按照试剂盒说明书要求配置cDNA反应液进行逆转录反应，然后在装有相应PCR预混液的PCR管中加入上述cDNA液5 μL，总反应体系25 μL，应用ABI 7500仪进行PCR扩增，扩增条件：预变性42℃，5 min，95℃，10 min；PCR循环：(94℃，15 s；60℃，60 s)40个循环,在PCR循环第二步60℃时收集荧光信号。按照说明书进行BCR-ABL、TEL-AMLl、E2 A-PBX1、MLL-(MLL，AF4，AF6，AF9，AF10，ENL，AF17，AF1q，AF1p，ELL，SEPT6)、TEL-JAK2、AML1-ETO、CBFβ-MYH11、FIP1 L1-PDGFRA、DEK-CAN、AML1-MDS1/EVI1、AML1-MTG16、NPM-MLF、SIL-TAL1、SET-TAL1、SET-CAN、TEL-PDGFRB、TLS-ERG、NUP98-(HoxA11、HoxA11、HoxD13、HoxA9)，(NPM，FIP1 L1，STAT5 b，PML，PLZF)-RARα和TEL-ABL结果判定。

1.4 统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析，计数资料(CD抗原阳性率、男女比例等)比较采用Person卡方检验及Fisher精确检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 5种常见融合基因的表达情况

120例B-ALL患儿检测到融合基因阳性共45例，总检出率为37.5%，包括TEL/AML1、E2 A/PBX1、BCR/ABL1、MLL、TLS/ERG 5种融合基因，分别为27例、7例、6例、4例、1例，各占60.0%、15.6%、13.3%、8.9%、2.2%，其中MLL相关的伙伴基因共检出3种，分别为：MLL/AF4(2例)、MLL/AF10(1例)、MLL/ENL(1例)。

2.2 融合基因阳性的B-ALL患儿性别及年龄分布情况

TEL/AML1、E2 A/PBX1及BCR/ABL1融合基因阳性组在1～10岁儿童患者中占比最高，其阳性率分别为：96.3%(26/27)、85.7%(6/7)、83.3%(5/6)；MLL基因阳性的B-ALL主要发生在1岁以下儿童，其阳性率为75%(3/4)；TLS/ERG融合基因阳性发生在1例1岁5个月的患儿。各融合基因阳性组及阴性组患儿不同年龄段分布差异有统计学意义(P<0.01)，性别分布差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1融合基因阳性的B-ALL患儿性别及年龄构成情况

2.3 融合基因阳性的B-ALL患儿免疫表型特征

各融合基因阳性组CD19阳性率为100%；27例TEL/AML1阳性表达患者中，21例为普通-B-ALL表型，6例为前-B-ALL表型，干/祖细胞抗原CD34的阳性率为81.5%(22/27)；7例E2 A/PBX1阳性表达患者中，6例为前-B-ALL表型，1例为成熟-B-ALL表型，不表达CD34；6例BCR/ABL1阳性表达患者中，3例为普通-B-ALL表型，2例为前-B-ALL表型，1例为成熟-B-ALL表型，CD34阳性率为100%；4例MLL阳性患者表达的B-ALL抗原有CD22(100%)、CyCD79 a(75%)、CD10(50%)、CD9(50%)、CyIgM(50%)；各融合基因阳性组B-ALL均不表达T系抗原CD3、CD4、CD5和CD8，1例MLL基因阳性B-ALL患儿表达CD2和CD7；各组融合基因阳性B-ALL髓系抗原表达以CD33、CD13、CD66c最常见，在TEL/AML1阳性组中CD33和CD13阳性率分别为74.1%(20/27)、33.3%(9/27)，BCR/ABL1阳性组以CD66 c阳性率最高，为100%(6/6)，其次为CD33，阳性率为66.7%(4/6)，各基因阳性组不表达髓系抗原CD117、CD64、CD14、cMPO、CD11 b；E2 A/PBX1阳性组不表达已知的T系及髓系抗原。见表2。

表2融合基因阳性的B-ALL患儿抗原表达情况[n(%)]

2.4 融合基因阳性的B-ALL患儿髓系抗原表达比较

6例BCR/ABL1阳性表达患者均表达髓系抗原，27例TEL/AML1阳性组髓系抗原表达阳性率为74.1%，7例E2 A/PBX1阳性表达患者不表达髓系抗原，各融合基因阳性组及阴性组患儿髓系抗原阳性率比较差异有统计学意义(P<0.01)，见表3。

表3融合基因阳性的B-ALL患儿髓系抗原表达构成情况[n(%)]

3 讨 论

ALL是儿童恶性肿瘤中最常见的类型，随着白血病诊断技术的不断提高及化疗方案的改进，如今儿童的10年总生存率可达到(76.5±1.5)%[5]。儿童ALL疗效的显著提高主要依赖于疾病早期进行MICM分型及个体化治疗[6]，表达特殊免疫表型及融合基因与ALL患儿预后关系密切，可为临床危险度分级及个体化治疗提供依据[7]。本研究对120例患儿进行43种融合基因检测，共检出5种常见的融合基因，包括：TEL/AML1、E2 A/PBX1、BCR/ABL1、MLL/(AF4，AF10，ENL)、TLS/ERG，总检出率为37.5%，高于赵莉[8]等报道的阳性率(30%，15/50)，可能与统计的患儿例数差异有关。

TEL/AML1融合基因与染色体t(12；21)易位相关，是B-ALL患儿预后良好的指标之一[9]。本研究显示，5种常见融合基因中TEL/AML1阳性率最高，占B-ALL患儿总例数的22.5%，与张建平[10]等研究结果一致。既往研究显示[11]，TEL/AML1融合基因阳性B-ALL以普通-B-ALL和前-B-ALL表型为主，早前-B-ALL和成熟-B-ALL表型极少见，本研究27例TEL/AML1融合基因阳性患儿中21例为普通-B-ALL表型，6例为前-B-ALL表型，与报道相符。E2 A/PBX1融合基因与染色体t(1；19)易位相关，在儿童ALL中占3%～5%，主要发生在年龄偏大的儿童。本研究7例E2 A/PBX1阳性患儿均缺乏CD34的表达，以前-B-ALL表型为主，这与唐燕萍[12]等报道一致。BCR/ABL1融合基因系t(9；22)易位所致，其发生率与年龄显著相关，在B-ALL中以成人多见。本研究表达BCR/ABL1融合基因的阳性率为5%，远低于成人的20%～25%。在免疫表型方面，本研究6例BCR/ABL1阳性患儿均表达CD34，CD34是目前研究较多的一个干/祖细胞抗原，主要表达于分化较差的白血病亚型[13]， CD34的高表达可能是影响BCR/ABL1阳性患儿治疗效果不良的因素之一。MLL基因重排发生于11 q23染色体，以1岁以内婴幼儿为主，通常为早前-B-ALL表型，伴MLL基因重排的白血病患儿预后差。本研究中MLL组可表达T系相关抗原CD2、CD7，白血病相关抗原异质性更明显，可能与预后不良有关。TLS/ERG融合基因是一种少见的特异性染色体重排，阳性患者预后不良[14]。既往报道[15]，TLS/ERG融合基因表现为前-B-ALL表型，唐艳萍[12]等研究显示，TLS/ERG融合基因除前-B-ALL表型外，还可有早前-B-ALL和普通-B-ALL表型，本研究中1例TLS/ERG融合基因阳性患儿为普通-B-ALL表型。

本研究在对5种常见融合基因是否表达髓系抗原的分析中发现，E2 A/PBX1阳性组不表达髓系抗原，其他组均有不同程度的阳性率，以BCR/ABL1组阳性率最高(100%)，其次为TEL/AML1组(74.1%)。TEL/AML1组髓系抗原以CD33(74.1%)、CD13(33.3%)为主，CD66 c表达仅7.4%，BCR/ABL1组髓系抗原以CD66 c(100%)、CD33(66.7%)为主，其次为CD33(33.3%)，两者髓系抗原分布特征明显。以往研究有部分学者认为伴髓系抗原的ALL预后差[16]，大多数观点又认为髓系抗原表达与疾病预后无相关。本研究根据报道的5种常见融合基因预后可推测髓系抗原表达阳性率高低与疾病预后无相关，可能与特殊的CD分子表达相关。在CD34表达方面，TEL/AML1组与TLS/ERG5组不表达CD34，与其他组比较差异有统计学意义。MLL组可表达T系相关抗原，其他融合基因组均不表达，可用于表达MLL融合基因的预测。

综上所述，表达融合基因的急性B-ALL患儿的年龄构成及免疫表型中具有一定的分布特点，其特征性免疫表型的改变可用于初诊时融合基因表达的预测，提高融合基因结果判读的准确率。本研究不足之处在于融合基因阳性例数较少，有待以后扩大样本总量积累更多的阳性例数再做进一步的研究。