白芨多糖对胃溃疡模型大鼠胃组织IL-17、IL-23、TLR-4及NF-κB p65基因和蛋白表达水平影响的研究①

巩子汉 段永强 成映霞 虎峻瑞 王 强 付晓艳 白 敏

(甘肃中医药大学，兰州 730000)

胃溃疡(gastric ulcer，GU)作为一种常见多发的消化性溃疡疾病，临床迁延难愈、易反复发作[1]。研究表明物理刺激及化学反应等均可致使胃黏膜发生氧化应激损伤，促炎症细胞因子的大量释放也是胃溃疡发病的主要因素[2]。白芨味苦性微寒，有止血消肿，生肌敛疮之功效，与黄连、贝母、轻粉等配伍可治疗疮痈已溃，久不收口者。正如《神农本草经》所载：“白芨味苦，主痈肿，败疽，胃中邪气，恶疮不收”。白芨的主要化学成分为白芨多糖，其可促进大鼠胃溃疡创面的愈合，其机制可能与白芨多糖可以提高创面羟脯氨酸含量，促进创面组织中纤维细胞、血管内皮细胞的增生，提高创伤巨噬细胞含量有关[3]。本实验研究白芨多糖对GU模型大鼠一般生存状况及胃组织病理改变的影响，胃组织TLR-4、NF-κB p65基因及蛋白的表达水平，以及下游细胞因子IL-17、IL-23含量的干预效应，进一步探讨白芨多糖治疗GU的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1药物 白芨多糖，含量(Assay by HPLC)：99%购于西安泽郎生物科技有限公司，批号：XAZL171026-1；盐酸雷尼替丁购于湖南汉森制药股份有限公司，批号：1808202；将白芨多糖按0.5 g、0.25 g、0.125 g溶于10 ml双蒸水中，分别制成0.5 g/kg、0.25 g/kg、0.125 g/kg的试剂，盐酸雷尼替丁按0.3 g溶于10 ml双蒸水中，制成0.3 g/kg试剂，分别置于4℃冰箱以备灌胃使用。

1.1.2动物 SPF级健康Wistar大鼠60只，雌雄各半，2月龄，体质量(180±10)g，由甘肃中医药大学医学实验中心提供，动物合格证号SCXK(甘)2015-0002。于甘肃中医药大学SPF级实验室常规饲养，相对湿度45%～55%，室温22～25℃，自由饮水进食。实验动物处理遵守实验动物伦理原则。

1.1.3试剂 Albumin Bovine V(批号：Lot.No.829Q052)，Tris 8.8(批号：Lot.No.20180928)均购于北京索莱宝科技有限公司；冰乙酸(批号：2017年3月27日)购于天津市富宇精细化工有限公司；IL-17、IL-23酶联免疫试剂盒(批号：201901)购于上海将来实业股份有限公司；TRIzol(批号：LoT152104)购于美国Ambion公司；Real Time qPCR试剂盒(批号：Lot No.AI61180A)购于TaKaRa公司；GAPDH抗体(批号：Lot：B1501)购于美国ImmunoWay公司；NF-κB p65抗体，TLR-4抗体(批号：Lot No.821701523，Lot No.821701346)均购于GeneTex公司；辣根酶标记山羊抗兔IgG(批号：112971)购于北京中杉金桥生物科技有限公司；PageRuler Prestained Protein Ladder(批号：Lot No.00442922)购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.1.4主要仪器 CT14RD型高速低温离心机购于上海天美生化仪器设备工程公司；Benchmark Plus酶联免疫检测仪、BIOMATE 3S核酸蛋白测定仪、Chemi DOC XRS+凝胶成像分析系统均购于美国Bio-Rad公司；SCIENTZ-48型高通量组织研磨器购于宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2方法

1.2.1大鼠的分组与处理 将60只SPF级Wistar大鼠适应性饲养3 d后按随机数字表法分为空白组、模型组、盐酸雷尼替丁组、白芨多糖大、中、小剂量组共6组，每组10只。在多种造模方法中乙酸灌胃法制作小鼠胃溃疡模型简便易行，相对胃黏膜注射法而言乙酸直接灼烧组发生的溃疡深而大，是理想的动物造模方法，故本研究参照文献[4]造模：大鼠术前禁食不禁水24 h，10%水合氯醛溶液20 mg/kg 体重腹腔内注射麻醉，常规处理后，自剑突下沿腹中线切开腹壁约2 cm打开腹腔，暴露胃前壁窦体部，自制直径为5 mm，长为40 mm的圆柱状装置按置于胃前壁胃窦部浆膜层处，吸取20 μl冰乙酸注入圆柱状装置中，直接烧灼60 s，再用生理盐水清创后覆盖网膜，缝合。待造模3 d后，随机抽取3只大鼠麻醉后脱臼处死，肉眼观察病灶处有无溃疡，周边是否充血水肿，HE切片观察病灶处是否有腺体消失、炎症细胞浸润或出现坏死层。确定GU模型制备成功后空白组及GU模型组大鼠给予蒸馏水灌胃，阳性对照组给予盐酸雷尼替丁(0.3 g/kg)灌胃，《中华人民共和国药典》2015年版一部中，白芨生药饮片成人用量6～15 g[5]，按每天平均用药量10 g折算成大鼠的用量为生药1.5 g/kg，但是受白芨药材产地、采收季节等影响，白芨多糖含量差异较大(33.11%～48.07%[6]、2.45%～23.57%[7])，综合考虑确定大鼠白芨多糖的给药剂量为0.25 g/kg，因此本实验选取大鼠给予白芨多糖0.5 g/kg、0.25 g/kg、0.125 g/kg作为大、中、小剂量组进行灌胃，1次/d，连续15 d。

1.2.2各组大鼠胃组织病理学改变 HE染色，4%多聚甲醛固定胃组织，石蜡包埋切片后，依次进行二甲苯脱蜡→酒精梯度脱水→苏木精染色→水洗→盐酸酒精→水洗→酒精梯度脱水→伊红染色→酒精脱水→二甲苯透明→中性树胶封片→光镜下观察。

1.2.3ELISA法检测各组大鼠血清及胃组织IL-17、IL-23含量 遵照ELISA试剂盒说明书按步骤检测大鼠血清及胃组织匀浆液中IL-17、IL-23含量，使用酶标仪测定450 nm波长时各孔吸光度，并绘制标准曲线，计算样品浓度。

1.2.4RT-PCR检测胃组织IL-17、IL-23、TLR-4及NF-κB p65基因表达水平 采用Trizol法提取总RNA，测定其OD260 nm/OD280 nm均在1.8～2.0之间，反转录后扩增。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。β-actin F：5′-TGACAGGATGCAGAAGGA-GATTAC-3′，R：5′-GAGCCACCAATCCACACAGA-3′，产物长度102 bp；IL-17 F：5′-AGCGTGTCCAAACACTGAGG-3′，R：5′-ACGTGGAACGGTTGAGGTAG-3′，产物长度125 bp；IL-23 F：5′-CGTATCCAGTGTGGTGATGGTT-3′，R：5′-AAGATGTCCGAGTCCAGT-AGGTG-3′，产物长度119 bp；TLR-4 F：5′-CTCTGGCATCATCTTCATTGTCCTT-3′，R：5′-GTTGTTGCTTCTTGTTCTTCCTCTG-3′，产物长度136 bp；NF-κB p65 F：5′-TCTTCGACTACGCGGTTACGG-3′，R：5′-CTCACGAGCTGAGCATGAAGG-3′，产物长度133 bp。以β-actin作为内参基因，反应体系及参数依据GoTaq 3-Step RT-qPCR试剂盒说明书设置。采用样点拟合法分析结果得到目的基因和β-actin 的Ct值，以β-actin为内参，用比较Ct值法计算相对表达量：ΔΔCt=(测试组目的基因Ct值-测试组内参基因Ct值)-(对照组目的基因Ct值-对照组内参基因Ct值)，相对表达量为2-ΔΔCt。

1.2.5Western blot法检测胃组织TLR-4及NF-κB p65蛋白表达水平 提取总蛋白，BCA法进行蛋白定量，SDS-PAGE电泳，转膜，封闭，配制抗体：GAPDH抗体溶液配制(1∶1 000)：GAPDH抗体10 μl，封闭液10 ml；TLR-4抗体配制(1∶1 000)：TLR-4抗体10 μl，封闭液10 ml；NF-κB p65抗体配制(1∶2 000)：NF-κB p65抗体5 μl，封闭液10 ml；37℃摇床4 h，1×TBST洗涤3次后加入HRP标记羊抗兔二抗，二抗溶液配制：辣根酶标记山羊抗兔(1∶5 000)：山羊抗兔二抗2 μl，牛奶封闭液10 ml；室温孵育1 h，TBST液洗涤，采用ECL法显影后用Bio-Rad Quantity One软件进行扫描分析。

2 结果

2.1白芨多糖对各组大鼠一般体征的影响 空白组大鼠精神状况良好，反应灵敏，饮食正常，皮毛浓密且有光泽，大便成形呈褐色；GU模型组大鼠在造模后出现饮食减少，精神萎靡，严重竖毛，皮毛色泽枯槁易落，便质少而软，并见血便现象；各治疗组在药物干预1周后，大鼠精神状态逐渐好转，饮食量持平或增加，毛色恢复光泽，脓血便逐渐消失，上述症状尤以白芨多糖大剂量组好转明显。

2.2白芨多糖对各组大鼠血清及胃组织IL-17、IL-23含量的影响 与空白组比较，GU模型组大鼠血清及胃组织IL-17、IL-23含量显著升高，差异具有统计学意义(P<0.01)；与GU模型组比较，白芨多糖大剂量组大鼠血清及胃组织IL-17、IL-23含量显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结果见表1。

2.3白芨多糖对各组大鼠胃组织病理变化的影响 空白组大鼠胃黏膜镜下各层组织结构排列完整，未见明显改变，腺体排列规整，无水肿、充血。GU模型组大鼠胃黏膜镜下可见腺体消失，有炎症细胞浸润，出现坏死层，有明显肉芽层及瘢痕组织；盐酸雷尼替丁组大鼠胃黏膜有少量腺体覆盖及炎症细胞浸润，坏死层减少；白芨多糖大剂量组大鼠胃黏膜出现较多腺体，炎症细胞浸润、坏死层明显减少；白芨多糖中剂量组大鼠胃黏膜腺体排列稀疏且不规整，可见大量炎症细胞浸润，坏死层减少；白芨多糖小剂量组大鼠胃黏膜损伤程度较重，坏死层及肉芽组织明显。结果见图1。

2.4白芨多糖对GU模型大鼠胃组织IL-17、IL-23、TLR-4及NF-κB p65基因表达水平的影响 与空白组比较，GU模型组大鼠胃组织IL-17、IL-23、TLR-4及NF-κB p65基因表达水平显著升高， 差异具有统计学意义(P<0.01)；与GU模型组比较，白芨多糖大、中剂量组大鼠胃组织IL-17及NF-κB p65基因表达水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，白芨多糖大剂量组大鼠胃组织IL-23及TLR-4基因表达水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。结果见表2。

GroupsDose(g/kg)Serum IL-17(pg/ml)Tissue IL-17(pg/mg)Serum IL-23(pg/ml)Tissue IL-23(pg/mg)Control-1.63±0.224.26±0.221.34±0.163.23±0.10Model-2.18±0.071)5.98±0.221)1.59±0.091)4.58±0.231)Rh0.3001.90±0.162)5.18±0.222)1.41±0.142)3.60±0.143)Bsp-h0.5001.88±0.272)4.54±0.223)1.37±0.172)3.31±0.173)Bsp-m0.2502.05±0.245.88±0.221.44±0.174.52±0.24Bsp-l0.1252.13±0.215.95±0.221.58±0.134.53±0.11

Note:Compared with the Control group,1)P<0.01;compared with the Model group,2)P<0.05,3)P<0.01.

GroupsDose(g/kg)IL-17 mRNA(2-ΔΔCT)IL-23 mRNA(2-ΔΔCT)TLR-4 mRNA(2-ΔΔCT)NF-κB p65 mRNA(2-ΔΔCT)Control-1.00±0.001.00±0.001.00±0.001.00±0.00Model-1.34±0.021)1.31±0.041)1.40±0.041)1.32±0.031)Rh0.3001.25±0.052)1.22±0.042)1.23±0.032)1.24±0.032)Bsp-h0.5001.23±0.043)1.20±0.022)1.20±0.032)1.20±0.053)Bsp-m0.2501.29±0.022)1.28±0.021.35±0.041.25±0.022)Bsp-l0.1251.32±0.061.29±0.041.39±0.021.31±0.04

Note:Compared with the Control group,1)P<0.01;compared with the Model group,2)P<0.05,3)P<0.01.

图1 各组大鼠胃组织病理形态(HE染色，×100)Fig.1 Pathological morphology of gastric tissues of rats in each group (HE,×100)

2.5白芨多糖对GU模型大鼠胃组织TLR-4及NF-κBp65蛋白表达水平的影响 与空白组比较，GU模型组大鼠胃组织TLR-4及NF-κB p65蛋白表达水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.01)；与GU模型组比较，白芨多糖大、中剂量组大鼠胃组织TLR-4及NF-κB p65蛋白表达水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。结果见表3、图2。

GroupsDose(g/kg)TLR-4(TLR-4/GAPDH)NF-κB p65(NF-κB p65/GAPDH)Control-0.49±0.030.53±0.03Model-1.49±0.121)1.20±0.141)Rh0.3000.53±0.033)0.58±0.022)Bsp-h0.5000.49±0.033)0.63±0.033)Bsp-m0.2501.06±0.192)0.89±0.052)Bsp-l0.1251.22±0.231.15±0.15

Note:Compared with the Control group,1)P<0.01;compared with the Model group,2)P<0.05,3)P<0.01.

图2 各组大鼠胃组织TLR-4及NF-κB p65蛋白表达免疫印迹图Fig.2 Immunoblot of TLR-4 and NF-κB p65 protein expression in gastric tissues of rats in each groupNote: 1.Control group;2.Model group;3.Ranitidine hydrochloride group;4.Bsp-h group;5.Bsp-m group;6.Bsp-l group.

3 讨论

胃溃疡是一种常见多发病，其发病机制多假设是环境因素作用于具有易感倾向的人群，继而激活淋巴细胞和巨噬细胞，释放一系列炎症介质和细胞因子，如IL-17及IL-23等，进一步激活某些信号通路，导致机体细胞免疫反应和体液免疫反应，并逐级扩大和持续，使胃黏膜免疫反应过度亢进导致胃损伤和一系列临床表现。有研究表明白芨多糖具有降低应激时大鼠的胃黏膜损伤的药理作用[8]。

Toll样受体(Toll like receptors，TLR)是由先天免疫系统细胞表达的一种跨膜蛋白，与机体免疫和炎症反应密切相关，TLR配体较多，其中TLR-4是介导内毒素/脂多糖激活的信号转导受体，是位于细胞膜上作为TLR-4/NF-κB信号通路的起点，激活后的TLR可活化核转录因子NF-κB信号通路，致使细胞因子如IL-17、IL-23等的产生及抗原呈递细胞在适应性免疫反应中对T细胞共刺激的激活以参与免疫和炎症反应。有研究表明NF-κB作为炎症反应的重要调节枢纽又是TLR-4/NF-κB信号通路的终点，通过NF-κB的激活、核转位，继而下游一系列炎症因子转录和表达，最终产生级联放大的炎症反应[9，10]。本实验结果显示，GU模型大鼠胃黏膜组织TLR-4、NF-κB p65基因及蛋白表达水平显著升高，而白芨多糖大剂量组和盐酸雷尼替丁组均能显著降低TLR-4、NF-κB p65基因及蛋白表达水平。

IL-17和IL-23都是重要的免疫因子，IL-17主要由Th17细胞分泌，它能够激活巨噬细胞、树突状细胞等多种免疫细胞产生如IL-6、TNF-α、趋化因子及基质金属蛋白酶等大量致炎因子，引起并加重炎症细胞浸润和组织损害[11]。IL-23是一种二聚体结构的致炎因子。主要由巨噬细胞和树突状细胞分泌，可直接作用于破骨细胞，刺激破骨细胞的分化及活化，上调破骨细胞数量及活性，刺激CD4+T细胞转化为Th17细胞，并对Th17细胞的功能维持有重要作用，使Th17细胞产生强效致炎因子IL-17[12，13]。本研究结果显示，GU模型大鼠血清及胃黏膜组织IL-17、IL-23含量和基因表达水平显著升高，而白芨多糖大剂量组和盐酸雷尼替丁组均显著降低IL-17、IL-23含量和基因表达水平。

综上所述，本实验通过乙酸直接烧灼法成功复制GU模型，GU模型组大鼠病理切片见胃底腺结构紊乱，胃黏膜上皮细胞脱落；而胃黏膜损伤可能与TLR-4、NF-κB p65高表达，诱发促炎因子IL-17、IL-23异常分泌而加重炎症反应有关；经药物治疗后与模型组比较，白芨多糖大剂量组大鼠胃黏膜出现较多腺体，炎症细胞浸润，坏死层等损伤得到改善或减轻，同时血清及胃黏膜细胞因子IL-17和IL-23含量降低，TLR-4、NF-κB p65基因及蛋白表达水平降低，且以白芨多糖大剂量组作用显著，说明白芨多糖可通过下调TLR-4、NF-κB p65基因和蛋白表达，进而抑制促炎因子IL-17和IL-23的异常分泌，减轻炎症级联放大反应，发挥保护胃黏膜组织及其功能的作用。