白纹伊蚊唾液rAlb-34k2蛋白可黏附大肠杆菌并抑制其生长①

田炎珅 徐 倩 金 芮 朱亚妮 商正玲 王政艳 程金芝 吴家红

(贵州医科大学基础医学院免疫学教研室，贵阳 550025)

蚊是一类重要的医学昆虫媒介，通过叮咬过程经蚊唾液向人类传播疾病。蚊唾液中不仅具有调控蚊虫吸食、吸血、传播蚊媒病原等功能的蛋白分子[1-4]，同时也包括多种免疫活性分子，如C型凝集素、肽聚糖识别蛋白、溶菌酶等，参与维护蚊自身的免疫防御功能[5-8]。由于蚊唾液蛋白在蚊免疫防御与其向宿主传病致病中的双重作用，使得发现并阐明新的蚊唾液蛋白的免疫活性功能至关重要。据推测蚊唾液腺可分泌上百种生物活性蛋白，且大多数功能不清[5]。埃及伊蚊和白纹伊蚊是传播登革病毒、寨卡病毒、基孔肯雅病毒等虫媒病毒的主要蚊媒，在我国白纹伊蚊分布广泛[9]。研究者在伊蚊属雌蚊唾液腺转录组中发现一组高表达、特异性的34k蛋白家族，并证实含有34k1和34k2两个分泌性蛋白成员[10-12]。生物信息学预测未发现该家族蛋白存在可寻的生物学活性[13]。本课题组前期通过原核重组表达获得了白纹伊蚊(广州株)唾液34k2蛋白(rAlb-34k2)，在本文中利用细菌结合实验探讨rAlb-34k2蛋白对大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、乙型溶血性链球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌的黏附效应，同时以重组表达的同源蚊唾液的C型凝集素蛋白(命名为：rAalb-CTL2)为对照，分析对大肠杆菌生长OD600值的影响，以期为发现白纹伊蚊唾液腺高表达的34k2蛋白的免疫生物活性提供实验依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1重组蛋白 重组白纹伊蚊雌蚊唾液34k2蛋白[13](后文均简写为rAlb-34k2)、重组白纹伊蚊雌蚊唾液CTL2蛋白(后文均简写为rAalb-CTL2)，均为本实验室构建、表达、纯化并获得原核表达的可溶性蛋白。

1.1.2细菌 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌为本实验室常规培养保存；鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、乙型溶血性链球菌为贵州医科大学检验学院杨蕾老师提供。

1.1.3主要试剂和仪器 兔抗rAlb-34k2多克隆抗体为本实验室制备，HRP标记的山羊抗兔IgG抗体购于Invitrogen公司，彩虹180 kD广谱蛋白Marker购于北京Solarbio公司，ECL发光液购于美国Bio-Rad公司。DYX-DH隔水式电热恒温培养箱为上海跃进医疗器械厂产品，Epoch 2型超微量微孔板紫外分光光度计购于美国BioTek公司，多功能成像分析系统购于美国Bio-Rad公司，6YY-6型电泳仪购于北京六一生物科技有限公司，3D漩涡混合仪购于常州朗越仪器制造有限公司。

1.2方法

1.2.1细菌的培养 将各细菌菌种接种于LB固体培养基，37℃电热恒温培养箱中培养24 h，次日挑取单克隆菌至LB液体培养基，37℃、200 r/min气浴恒温振荡器培养16 h，取对数生长期的细菌菌液用于后续实验。

1.2.2Western blot检测rAlb-34k2蛋白与细菌结合情况 5 000 r/min离心5 min，收集2 ml菌液中的菌体，用500 μl TBS缓冲液重悬菌体沉淀，加入500 μl rAlb-34k2蛋白溶液(终浓度为200 μg/ml)，阴性对照组加入500 μl TBS缓冲液，于室温下3D旋转混合仪上孵育1 h，5 000 r/min离心5 min收集菌体沉淀后用TBS缓冲液洗涤5次，用200 μl 7%SDS溶液孵育菌体10 min，离心收集最后的菌体沉淀和7%SDS上清液。将末次TBS洗脱液、7%SDS上清液及菌体沉淀作为样品进行 SDS-PAGE，转膜后利用兔抗rAlb-34k2蛋白多克隆抗体(5%脱脂奶粉稀释1∶8 000)和HRP标记的山羊抗兔IgG抗体(5%脱脂奶粉稀释1∶10 000)进行Western blot检测[14]。

1.2.3分光光度计法检测不同浓度的rAlb-34k2蛋白对大肠杆菌生长的影响 将对数生长期的大肠杆菌(1 μl/孔)和10×LB液体培养基(10 μl/孔)加入96孔板，再按下述分组进行加样：①rAlb-34k2蛋白组：在细菌悬液中加入终浓度分别为137、112、96、64、48、32、16 ng/μl的rAlb-34k2蛋白溶液；②含Ca2+的rAlb-34k2蛋白组：在①组的基础上各孔加入终浓度为30 mmol/L 的CaCl2溶液；③rAalb-CTL2蛋白对照组：在细菌悬液中加入终浓度与①组一致的rAalb-CTL2蛋白溶液；④含Ca2+的rAalb-CTL2蛋白对照组：在③组的基础上各孔加入终浓度为30 mmol/L 的CaCl2溶液；⑤空白对照组。每组设置5个复孔，各孔总体积为100 μl。37℃培养，每隔4 h用超微量紫外分光光度计检测振荡后的各孔OD600值的变化。

2 结果

2.1rAlb-34k2蛋白可黏附多种细菌 rAlb-34k2蛋白与各细菌共孵育，利用Western blot检测末次TBS洗脱液、7%SDS处理后上清液及细菌沉淀中rAlb-34k2蛋白，如图1所示，各细菌组末次TBS洗脱液中未检测到rAlb-34k2目的蛋白。在7%SDS处理的大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌的细菌上清液及菌体沉淀中均可检测到目的蛋白，同时在7%SDS处理的铜绿假单胞菌上清液中也检测到阳性条带，而处理的乙型溶血性链球菌上清液及菌体沉淀中均未检测到rAlb-34k2蛋白；该结果提示rAlb-34k2蛋白可与大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌结合，而不能与乙型溶血性链球菌结合。

2.2不同浓度的rAlb-34k2蛋白可降低大肠杆菌的OD600值 基于rAlb-34k2蛋白可黏附大肠杆菌， 本实验用分光光度计法检测不同浓度的rAlb-34k2蛋白对大肠杆菌生长的OD600值影响。由图2A、B可知，137 ng/μl和112 ng/μl浓度的rAlb-34k2蛋白组的大肠杆菌OD600值曲线平缓，24 h内OD600值分别波动在0.063～0.294和0.097～0.349，且rAlb-34k2蛋白对大肠杆菌的生长影响与Ca2+的存在无关。选择12 h和24 h时各组的OD600值进行统计学分析,发现与空白对照组相比，各浓度的rAlb-34k2蛋白组的大肠杆菌OD600值均不同程度下降，且具有统计学意义(图3A～G)。此外，不同浓度的rAalb-CTL2蛋白(137 ng/μl、112 ng/μl和96 ng/μl)在Ca2+存在时具有促进大肠杆菌生长的效应。

图1 rAlb-34k2蛋白与不同细菌结合的Western blot检测结果Fig.1 Western blot analysis of rAlb-34k2 protein binding to different bacteriaNote: M.Protein marker;1.Bacteria sediments;2.rAlb-34k2 protein;3.Last TBS eluent;4.7%SDS supernatants.

利用同样的方法检测rAlb-34k2蛋白对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌OD600值的影响，但均未发现明显差异(数据未展示)。

3 讨论

蚊唾液内含有多种模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)，如C型凝集素、肽聚糖识别蛋白、革兰阴性菌结合蛋白等，通过结合和识别病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)实现固有免疫反应中的免疫识别效应[15,16]，而PAMPs是广泛分布于病原微生物表面某些共有的高度保守的分子结构[17,18]。本研究不仅发现rAlb-34k2蛋白与大肠杆菌、鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌有较强的黏附效应，同时在铜绿假单胞菌组中发现经7%SDS变性剂处理的细菌上清中可检测到目的蛋白，而细菌沉淀中目的蛋白消失，说明rAlb-34k2蛋白与铜绿假单胞菌之间也存在较弱的黏附效应。综上，我们推测这些黏附效应可能与rAlb-34k2蛋白具有识别这些细菌表面共同的保守结构有关。由于rAlb-34k2蛋白与不同种类细菌的黏附存在差异，其所黏附的配体分子结构尚不明晰，rAlb-34k2蛋白是否属于一种蚊源的PRRs尚待更多的实验证据。

Ribeiro等[19]发现伊蚊属雌蚊中含34k1和34k2两个特异性分泌性蛋白[20]，Hastings等[21]利用酵母展示技术发现埃及伊蚊唾液腺中34k蛋白家族成员十分丰富，Surasombatpattana等[22]发现埃及伊蚊唾液34k1重组蛋白可增强DENV感染人角质形成细胞，而目前关于伊蚊属雌蚊唾液特异性34k2蛋白的生物学功能尚无文献报道。本课题组前期通过双向电泳及质谱技术发现饱血后白纹伊蚊唾液腺中34k2蛋白显著下调[23]，本研究所锚定的rAlb-34k2蛋白是源自白纹伊蚊雌蚊唾液腺34k2基因的原核重组蛋白。基于rAlb-34k2蛋白可黏附多种细菌的结果，我们继而探讨了不同浓度的rAlb-34k2蛋白对大肠杆菌生长OD600值变化的影响，实验结果显示，与空白对照组相比，在细菌对数生长期(12 h左右)不同浓度的rAlb-34k2蛋白抑制大肠杆菌OD600值升高均具有显著的统计学意义，其中以高浓度的rAlb-34k2蛋白(137 ng/μl、112 ng/μl)抑制大肠杆菌OD600上升的作用较为显著。而该研究中rAlb-34k2蛋白并未影响金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的OD600值变化(数据未展示)。此外，我们还观察到同源的rAalb-CTL2蛋白(一种来源于白纹伊蚊唾液腺的C型凝集素家族成员)处理大肠杆菌后，在Ca2+依赖下可促进大肠杆菌OD600上升的相反结果，提示rAlb-34k2蛋白可能是一类与C型凝集素家族具有不同生物学效应的蚊唾液蛋白分子。细菌生长受多种因素影响，本研究中rAlb-34k2蛋白抑制大肠杆菌OD600增加的机制尚需进一步的研究证明。

白纹伊蚊在我国分布十分广泛，其作为一种重要的传病媒介在医学上具有举足轻重的地位。据估计伊蚊属雌蚊唾液腺可分泌上百种差异蛋白组分，迄今对这些蚊唾液蛋白的生物学功能的认识尚属于起步阶段。本研究发现rAlb-34k2蛋白可与多种不同细菌黏附，并对大肠杆菌的生长有一定的抑制效应，将为今后深入探讨伊蚊属唾液特异性34k2蛋白的生物功能及其与宿主免疫的相互关系提供前期的实验依据。