知柏地黄汤通过调节ARE信号通路激活细胞抗氧化反应治疗阴虚火旺证的机制研究

浙江中医药大学 杭州 310053

氧化应激（oxidative stress，OS）是指体内氧化与抗氧化作用失衡，产生大量氧自由基，在损伤部位导致中性粒细胞浸润，蛋白酶分泌增加的现象，被认为是导致衰老和疾病的重要因素之一。研究认为，长期的OS反应会导致慢性炎症，最终造成全身各组织器官的疾病[1]。OS导致的慢性炎症过程与多种疾病的发病机制相关，且在疾病的进程中发挥着相似的作用，如糖尿病、肥胖等[2]。阴虚火旺证是中医学的证候概念，表现为机体阴液亏少，阳气偏亢。研究发现，阴虚火旺证患者也表现为炎性因子水平上升[3]，其临床表现与OS导致的慢性炎症反应相似。抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）信号通路由核因子红细胞2相关因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2）和 Kelch样 ECH 相关蛋白 1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1） 两个元件构成，其中Nrf2是调节细胞氧化还原状态的转录因子，Keap1是一种对Nrf2具有负调控作用的细胞质蛋白，能抑制Nrf2的反式激活活性[1,4]。

知柏地黄汤出自《医宗金鉴》，是六味地黄汤的加减方之一，在原方基础上加上知母和黄柏，滋阴清火的作用强于原方六味地黄汤，主治肝肾阴虚、虚火上炎证，现代研究发现其具有降血糖、增强免疫、抗氧化、抗疲劳、调节神经内分泌及抗肿瘤的作用[5]。干姜附子肉桂汤由干姜、附子、肉桂三味大辛、大热的药物组成，前期研究发现该方长期给药可建立阴虚火旺证动物模型[6-7]。本研究拟探讨知柏地黄汤对细胞OS的调节作用以及对阴虚火旺证的治疗机制，以期为知柏地黄汤治疗阴虚火旺证提供进一步的实验依据。

1 材料和方法

1.1 细胞和实验动物 人肝癌细胞系HepG2细胞购于中国科学院上海细胞库。SPF级雌性SD大鼠45只，6～8 周龄，体质量（200±20）g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物生产许可证号码：SCXK（沪）2012-0002]，饲养于浙江中医药大学动物实验中心 [实验动物使用许可证号码：SYXK（浙）2013-0184]，所有动物自由摄食、饮水。本研究通过浙江中医药大学实验动物管理及福利伦理审查（决议编号：ZSLL-2016-104）。

1.2 主要药品和试剂 知柏地黄汤由知母24g、黄柏24g、熟地黄 24g、山茱萸 12g、山药 12g、泽泻 9g、茯苓9g、丹皮9g煎制；干姜附子肉桂汤由淡附片200g、干姜200g、肉桂200g煎制，上述饮片均由浙江中医药大学中药饮片厂提供。以单蒸水煎煮后采用R202型旋转蒸发器浓缩成1g·mL-1的药液，部分制成冻干粉。所有药液均于实验前配置，并以0.22μm薄膜滤菌器（爱尔兰Merck Millipore公司产品，批号：SLGP033RB）过滤除菌。RPMI-1640细胞培养基、胎牛血清购于吉诺生物医药技术有限公司（批号：E9020、12250）；缺氧诱导因子-1 （hypoxia inducible factor-1，HIF-1）-Luciferase 购于上海吉满公司 （批号：GM-021020）；肿瘤抑制因子p53反应元件（promoter tumor suppressor protein 53，pp53） -Luciferase、ARE-Luciferase和 Renilla-Luciferase购于北京碧云天生物技术有限公司 （批号：D2223、D2112、D2768）；高纯质粒大量提取试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司（批号：DP117）；SuperFectinTMⅡDNA转染试剂盒购于上海普飞生物技术有限公司（批号：2102-100）；Dual-Luciferase®Reporter Assay System试剂盒购于美国Promega公司（批号：E1910）；Life TechnologiesTMTRIzol®Reagent购于赛默飞公司（批号：15596026）；dNTP、RecombinantRNaseInhibitor、Reverse Transcriptase M-MLV、Oligo(dT)18 primer和 TB Green购于TaKaRa公司 （批号：4019、2313A、2641A、3806、RR420A）； 三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）含量检测试剂盒（比色法）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）检测试剂盒均购于南京建成生物工程研究所 （批号：A095-1-1、E001-3）；MitoXpressXtra Oxygen Consumption Assay Kit购于安捷伦公司（批号：MX-200-4）；抗霉素、三氟甲氧基苯腙羰基氰化物 （carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone，FCCP）购于美国Sigma 公司（批号：A8674、C2920）。Eclipse Plus C18色谱柱购于美国安捷伦公司。

1.3 主要仪器 CO2恒温培养箱和多功能酶标仪购于美国Thermo公司；荧光定量PCR仪由美国Roche公司提供；One Drop OD-1000超微量紫外分光光度计购于上海诺晶生物科技有限公司；Centrifuge 5417R高速冷冻离心机购于德国Eppendorf公司。

1.4 细胞实验

1.4.1 细胞培养 HepG2细胞以含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养，至细胞覆盖培养瓶底面积80%～90%时，用于后续实验。

1.4.2 双萤光素酶报告基因实验 按照高纯质粒大量提取试剂盒说明书抽提以下质粒：HIF-1-Luciferase、pp53-Luciferase、ARE-Luciferase 和 Renilla-Luciferase。将HepG2细胞接种于48孔板，当细胞覆盖孔底面积70%～80%时，采用所提质粒，按照Super-FectinTMⅡ DNA转染试剂盒说明书所示方法对细胞进行转染，即每孔体系包括目标质粒0.3μg、Renilla 0.03μg、SuperFectinTMⅡ DNA转染试剂 1μL和培养基300μL。24h后将细胞分为4组，分别加入知柏地黄汤，对照组终浓度为 0mg·mL-1、低浓度组 1mg·mL-1、中浓度组 20mg·mL-1、高浓度组 100mg·mL-1，每组分别设3个复孔。知柏地黄汤浓度参考临床成人用量，并经预实验确定。恒温培养24h后按照Dual-Luciferase®Reporter Assay System试剂盒说明书裂解细胞，离心后取20μL上清液移入96孔板，每个样本加入25μL萤光素酶检测试剂Ⅱ，以多功能酶标仪检测萤火虫萤光素的发光强度，同一个样本继续加入25μL Stop&Glo®试剂，以多功能酶标仪检测海肾萤光素发光强度，计算二者比值即为相对转录活力。

1.4.3 荧光定量PCR检测Nrf2、小肌腱膜纤维肉瘤（musculoaponeurotic fibrosarcoma，Maf）、Keap1 mRNA相对表达量 将HepG2细胞接种于6孔板，培养24h后予各浓度的知柏地黄汤处理24h。收集细胞并提取总RNA，逆转录cDNA后进行荧光定量PCR反应，根据基因库中 β-Actin、Nrf2、Maf、Keap1 的核苷酸序列设计引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。反应总体系为20μL，反应条件为：95℃变性 10min，循环重复 95℃变性10s，55℃复性 30s，72℃合成 30s，共 45个循环，完成目的基因的体外扩增；65℃～97℃分析熔解曲线。每个目的基因检测设3个复孔，导出结果后以2-ΔΔCt计算目的基因相对表达量。

1.4.4 ATP 含量、耗氧率（oxygen consumption rate，OCR）及SOD活性检测 将HepG2细胞接种于6孔板，培养24h后予各浓度的知柏地黄汤处理，2h后收集并破碎细胞，抽提蛋白，每组设3个复孔，用One Drop OD-1000超微量紫外分光光度计检测ATP含量、OCR及SOD活性，具体操作分别按ATP含量、OCR以及SOD活性检测试盒说明书进行。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5 动物实验

1.5.1 实验动物分组和造模 将45只SD大鼠随机分为 3 组，空白组以 0.9%氯化钠溶液 10mL/（kg·d）灌胃21d；干姜组以干姜附子肉桂汤10g/（kg·d）灌胃14d后，大鼠出现口腔黏膜局部红肿，甚者溃破，尿量减少、色黄，烦躁等阴虚火旺证的表现[6]，再以0.9%氯化钠溶液 10mL/（kg·d）灌胃 7d；干知组以相同剂量干姜附子肉桂汤灌胃14d后，出现上述阴虚火旺表现，再以知柏地黄汤10g/（kg·d）灌胃7d。3组大鼠均以普通饮食喂养。

1.5.2 血清样本收集 大鼠灌胃21d后，腹腔静脉取血，全血静置30min后，4℃下3 000r/min离心10min，收集血清，-80℃保存，用于血清代谢组学研究。

1.5.3 小鼠血清液相色谱-质谱联用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS） 代谢组学检测

1.5.3.1 血清样本前处理 室温解冻血清样本，取150μL血清置于EP管中，加入450μL乙腈沉淀蛋白，涡旋 30s，静置 10min后 4℃下 12 000r/min离心10min，取300μL上清液加入同体积去离子水稀释，稀释后的血清样品以0.22μm薄膜滤菌器过滤，弃去滤液，用于液相质谱分析。

1.5.3.2 色谱与质谱条件优化 经过预试验确定的最终色谱条件为：Eclipse Plus C18色谱柱 （2.1mm×50mm，1.8μm）；自动进样器温度为 5℃，柱温 35℃；流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：0.1%甲酸乙腈溶液，流速：0.2mL·min-1，后运行时间 4min，进样量 5μL；洗脱梯度：0min，95%A、5%B；4min，90%A、10%B；17min，55%A、45%B；22min，5%A、95%B。质谱主要参数：电喷雾离子源（electrospray ion source，ESI+）；质荷比（mass-to-charge ratio，m/z）50～1 000；干燥气 N2，流速 10L·min-1，温度 350℃；毛细管电压 4 000V，碎裂电压180V，锥孔电压60V；雾化气压力310kPa。质谱数据采用Centroid模式保存，采集速率为2spectrum/s。在分析过程中，使用质谱参比液，对仪器的运行进行监测，校准仪器的实时质量偏差。

1.5.3.3 结果分析 采用正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）模型的变量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值（阈值＞1），OPLSDA模型的可信度用参数 R2X、R2Y、Q2表示，其中R2X、R2Y表示模型的解释率；Q2表示模型的预测率，Q2＞0.4则此模型可靠，并结合 t检验的 P值（P＜0.05）寻找差异性表达代谢物。差异性代谢物的定性方法为：搜索Metlin在线数据库，比较质谱的m/z或者精确分子质量（mass）。

1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，两两比较采用独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞ARE、HIF-1、pp53转录活力比较 与对照组比较，知柏地黄汤中、高浓度组ARE的转录活力显著上升（P＜0.01，P＜0.05）；相反 HIF-1 转录活力出现降低，其中知柏地黄汤低、高浓度组差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.05）；而低浓度的知柏地黄汤可以增强pp53转录元件活力（P＜0.001）。见图1。此结果提示知柏地黄汤对ARE通路有调节作用。

图1 各组细胞ARE、HIF-1、pp53转录活力比较Fig.1 Comparison of transcriptional activities of ARE,HIF-1 and pp53 in each group

2.2 各组细胞Nrf2、Maf以及Keap1基因表达比较与对照组比较，知柏地黄汤低、中浓度组能够促进Nrf2 的基因表达（P＜0.001，P＜0.05），知柏地黄汤各浓度组均能促进 Maf的基因表达（P＜0.001，P＜0.05），知柏地黄汤各浓度组还能够抑制Keap1的基因表达（均 P＜0.001）。见表 2。

表2 各组细胞中Nrf2、Maf以及Keap1表达比较（±s）Tab.2 Comparison of Nrf2,Maf and Keap1 expression in each group(±s)

表2 各组细胞中Nrf2、Maf以及Keap1表达比较（±s）Tab.2 Comparison of Nrf2,Maf and Keap1 expression in each group(±s)

注：与对照组比较，*P＜0.05，***P＜0.001Note：Compared with control group,*P＜0.05,***P＜0.001

组别 Nrf2 Maf Keap1对照组 1 1 1知柏地黄汤低浓度组 25.489±0.081*** 13.425±0.063*** 0.196±0.006***知柏地黄汤中浓度组 6.394±0.057* 8.901±0.093*** 0.104±0.002***知柏地黄汤高浓度组 2.758±0.076 3.908±0.071* 0.043±0.002***

2.3 各组细胞ATP含量及OCR比较 与对照组比较，知柏地黄汤高浓度组细胞内ATP含量增加 （P＜0.05）；知柏地黄汤各浓度组细胞内OCR均增加（P＜0.001）。见图2。说明知柏地黄汤处理能够显著增强细胞能量代谢。

2.4 各组细胞SOD活性比较 与对照组比较，知柏地黄汤中、高浓度组细胞中SOD的活性明显升高（P＜0.05）。见图3。

2.5 各组模型大鼠代谢比较

2.5.1 OPLS-DA分析 本研究检测了大鼠血清的代谢物，并采用监督式方法OPLS-DA进行建模分析，结果提示干姜组和空白组之间R2X=0.306，R2Y=0.991，Q2=0.727；干知组和干姜组之间R2X=0.378，R2Y=0.994，Q2=0.796，干姜组和空白组以及干知组和干姜组之间的Q2均＞0.4，证明模型区分度好，数据可靠，表明后期进行组间比较得到的差异代谢物可信。见图4。

图2 各组细胞内ATP含量及OCR比较Fig.2 Comparison of intracellular ATP content and OCR in each group

图3 各组细胞SOD活性比较Fig.3 Comparison of intracellular SOD activity in each group

图4 各组大鼠OPLS-DA得分Fig.4 OPLS-DA scores in each group

2.5.2 差异代谢物分析 分析结果显示，空白组、干知组与干姜组血清样品中共同的差异代谢物为胆碱、甘胆酸以及棕榈酰左旋肉碱 （palmitoyl-L-carnitine，PALC）。与空白组比较，干姜组中胆碱和甘胆酸含量显著增高（P＜0.001，P＜0.01），而 PALC 含量降低（P＜0.01）。与干姜组比较，干知组胆碱含量减低 （P＜0.001），基本恢复正常；而甘胆酸含量差异无统计学意义（P＞0.05），PALC 的含量增高（P＜0.001）。见表 3。

3 讨论

阴虚火旺证是以咽干口燥、五心烦热、潮热盗汗、两颧潮红、舌红少苔、脉细数为主要临床表现的中医临床证型。知柏地黄汤是治疗阴虚火旺证的中医传统方剂，在临床上普遍用于口腔溃疡[8]、性早熟[9]、阴道炎[10]、糖尿病[11]等阴虚火旺患者的治疗。文献报道口腔溃疡、阴道炎、糖尿病等疾病的发作与OS异常关系密切，如复发性口腔溃疡患者体内，阴道炎患者阴道分泌物中过氧化物水平升高，过氧化物酶活性降低[12-13]；还有研究证实，糖尿病患者体内的OS反应是引起胰岛素抵抗和β细胞功能障碍的主要原因[14]。

表3 各组血清代谢差异物相对含量比较Tab.3 Comparison of relative content of serum differential metabolites in each group

知柏地黄汤由六味地黄汤加知母、黄柏而成，组方中重用熟地为君，与山茱萸、山药，君臣相伍，补肝脾肾；以泽泻、丹皮、茯苓为佐药，泻湿浊、降相火，平衡君臣之滋腻温涩，最后加知母、黄柏以增强其滋阴泻火作用，方中八味药物合用，共奏滋阴降火之效。现代药理学研究发现，八味药物均能拮抗OS反应：熟地黄、山茱萸可通过提高过氧化物酶的活性，降低体内过氧化物水平[15]；山药可增加过氧化物酶活性，清除氧自由基[16]；泽泻的有效成分可调节脂质过氧化、降低胆固醇、抑制OS反应[17-18]；丹皮具有抗炎、抗凋亡和抗氧化作用[19]；茯苓中的有效成分茯苓酸可通过抑制细胞外调节蛋白激酶 （extracellular regulated protein kinase,ERK）/Nrf2 通路，从而拮抗 OS 反应[20]；知母提取物具有抗炎、抗氧化、抗抑郁等作用[21]；黄柏及其提取物具有抗菌、抗炎、抗氧化等多种功效[22]。

机体在氧化还原反应过程中会产生ATP，同时也会产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）。在正常状态下，过量产生的超氧化物可被体内的SOD等催化分解，以维持机体内环境的ROS平衡[23]。本研究发现，知柏地黄汤会引起ATP合成及OCR增加、SOD活性升高，说明知柏地黄汤可以促进有氧呼吸途径，同时使细胞内氧自由基的清除能力增强。ARE是细胞核内氧化还原反应的重要调节因子，也是细胞抗氧化保护机制的激活因子[24]。当机体处于OS激活状态时，细胞质中的Keap1-Nrf2结构被破坏，Nrf2释放并进入细胞核与核内的Maf蛋白形成Nrf2-Maf异二聚体，再与ARE元件结合，激活ARE依赖的抗氧化相关基因表达[25-26]。本研究发现，知柏地黄汤显著激活ARE通路，表明知柏地黄汤抗氧化的作用可能是通过激活ARE通路实现的。

既往研究证实，干姜附子肉桂汤会增强OS反应，而机体的OS反应会显著改变机体内各种代谢物的种类及含量[27]。因此，本研究进一步以干姜附子肉桂汤灌胃，建立阴虚火旺证大鼠模型[6-7]，再以知柏地黄汤进行灌胃治疗，结果发现知柏地黄汤可以改善干姜附子肉桂汤引起的大鼠血清胆碱、甘胆酸、PALC含量的失衡。甘胆酸是胆汁酸和甘氨酸结合的胆汁酸，可促进ROS的产生[28]。热性药可以通过促进脂肪代谢提高机体的能量代谢水平[29-30]，胆碱也能促进脂肪代谢[31]，但是血清胆碱含量的显著降低或者升高对机体均会产生不良影响[32]，知柏地黄汤能够改善干姜附子汤引起的胆碱含量升高，但不会降低正常大鼠血清中胆碱含量，说明知柏地黄汤有助于改善阴虚火旺证机体代谢物的异常。此外，本研究中干姜附子肉桂汤灌胃后导致大鼠血清PALC含量降低，而知柏地黄汤治疗后PALC含量有所回升。PALC能够促进脂肪酸进入线粒体进行氧化分解，作为能量代谢的底物，为机体产生更多的ATP[33-34]，说明知柏地黄汤能够调节体内代谢物水平，从而促进ATP的合成。

综上所述，知柏地黄汤通过调节ARE信号通路，增加OCR、促进ATP合成、增强SOD活性，然后进一步改善阴虚火旺证的机体代谢异常，这可能是知柏地黄汤改善阴虚火旺症状的一个重要机制。