血管紧张素Ⅱ通过激活小G蛋白Rac1上调FGF13致心肌细胞肥大的机制研究

陈友铭，陈媛媛，陈宇涵，杨振伟，周 蕾，王岳鹏

（1.上海交通大学医学院附属新华医院心内科，上海 200092；2.皖南医学院附属弋矶山医院急诊科，安徽芜湖 241001；3.同济大学附属同济医院心胸外科，上海 200065）

心肌肥厚是心室肌对压力负荷增加以及神经体液生长激素分泌过多的一种代偿性反应。持续性的心肌肥大会导致心功能逐步失代偿，并恶化为心力衰竭［1⁃2］。血管紧张素（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ） 是触发体内肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin⁃angiotensin⁃aldosterone system，RAAS）的最重要激素［3］。AngⅡ通过激活细胞内小 G 蛋白 Ras 家族，继而激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPKs），促进心肌细胞肥大。小 G蛋白家族中Rac1 是Ras 家族中的主要成员之一，前期研究表明它在心肌肥厚中起着重要作用，但是具体机制还不明确。细胞内Rac1 的活性受到严密的信号调节，在与GDP 结合的失活状态及与GTP 结合的激活状态之间循环往复。在AngⅡ刺激下，心肌细胞Rac1 活性增高，进而促进心肌细胞肥大［4］。为了避免在 Rac1 的激活与失活的复杂调节中研究 Rac1 的功能，可以用 Rac1⁃V12 这种具有持久活性的Rac1 人工突变体来模拟持续的Rac1 激活状态。体外培养的心肌细胞超表达Rac1⁃V12，引起细胞肌丝增粗、肥厚相关蛋白表达上调［5］。

FGF13 是电压门控Na＋通道辅助亚基，前期研究证实，FGF13 促进压力负荷引起心肌肥厚［6］。为了探讨AngⅡ通过激活小G 蛋白Rac1 促进心肌细胞肥大的机制，本研究使用芯片技术筛选出FGF13。通过阻断小G 蛋白 Rac1 活性和降低FGF13 的表达，证明FGF13 在Ang Ⅱ诱导的心肌肥厚中发挥重要作用，从而为临床防治心肌肥厚提供有效的分子靶标。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Ad⁃Vector、Ad⁃Rac1、Ad⁃Rac1⁃V12 等腺病毒表达载体购自山东维真生物科技有限公司；胎牛血清、DMEM 培养基购自美国赛默飞世尔科技公司；Ⅱ型胶原酶购自美国 Worthington Biochemica 公司；GAPDH 兔多克隆抗体、Anp 兔多克隆抗体、β⁃Mhc兔多克隆抗体、Rac1 兔多克隆抗体、FGF13 兔多克隆抗体购自中国ABclonal 公司；Flag 鼠单克隆抗体、山羊抗兔二抗、SDS⁃PAGE 凝胶试剂盒、SDS⁃PAGE 蛋白上样缓冲液购自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 原代心肌细胞的分离和药物处理

取出生2～3 d 的SD 大鼠心脏，用4 ℃生理盐水冲洗，剪碎，用含0.25%胰蛋白酶的D⁃Hanks 盐溶液4 ℃消化16 h 后，用Ⅱ型胶原酶（100 U／mL）在 37 ℃水浴锅消化30 ～40 min，直至形成单细胞悬液。5%CO2、37 ℃培养箱中培养1 h 后去除成纤维细胞，细胞重悬，计数后接种于培养皿中，加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷使其终浓度为0.1 mmol／L。该方法心肌细胞纯度可达90%。心肌细胞培养于含10%胎牛血清，105U／L 青霉素，100 mg／L 链霉素的 DMEM 的低糖培养基。培养48 h 后换成无糖培养基，并分3 组进行实验：生理盐水刺激 48 h；Ang Ⅱ（1 μmol／L）刺激48 h；AngⅡ（1 μmol／L）和 Rac1 特异性抑制剂 NSC⁃23766（50 μmol／L）同时刺激 48 h。

1.3 小干扰RNA的合成及转染

siRNA 由北京擎科生物科技有限公司设计并合成，见表1。siRNA 转染心肌细胞：将原代心肌细胞铺至6 孔板中。当细胞融合度达到30%时，参照LipofectamineTM2000 转染试剂说明书，使用Lipofe⁃ctamineTM2000 将siRNA 转入细胞。将被转染siRNA的细胞分为 FGF13⁃si1 组、FGF13⁃si2 组、FGF13⁃si3组及阴性对照组NC⁃siRNA，并在转染6 h 后更换培养基。

表1 小干扰RNA 序列Tab.1 The sequence of small interference RNA

1.4 心肌细胞转染腺病毒并进行实验分组

（1） 空白对照组：转染带GFP 荧光蛋白的空载病毒12 h，换成DMEM 完全培养基继续培养24 h；（2） Rac1 组：转染 Rac1 病毒 12 h，换成 DMEM 完全培养基继续培养 24 h；（3） Rac1⁃V12 组：转染Rac1⁃V12 病毒 12 h，换成 DMEM 完全培养基继续培养 24 h；（4） Rac1⁃V12＋FGF13⁃si3 组：转染 Rac1⁃V12 病毒12 h，换成DMEM 完全培养基培养同时加入小干扰FGF13⁃si3 继续培养24 h。

1.5 激光共聚焦进行心肌细胞的鉴定及心肌细胞表面积的检测

心肌细胞以5×103／孔接种24 孔板中，分组处理后去除细胞培养液，加入4%的多聚甲醛固定15 min，0.3%Tritonx⁃100 室温通透 20 min，PBS 漂洗3 遍，用含5%驴血清的 PBS 室温封闭1 h，一抗孵育（α⁃actinin，1 ∶300）过夜，室温二抗［山羊抗兔IgG（H＋L）二抗 Cy3，1 ∶500］孵育 1 h，DAPI（1 ∶1 000）孵育10 min。细胞图像采用 LSM510 共聚焦显微镜拍摄。每次独立实验中，每组各取3 孔细胞进行处理，重复3 次实验。每孔细胞样品随机获取10 个不同视野的图片，每个图片取2 ～5 个细胞，并通过Image⁃J 软件测定3 次实验的细胞表面积，并计算其相对平均表面积［7］。

1.6 GST pull down实验

将培养的心肌细胞用 PBS 洗涤 3 次。加入1 mL 裂解缓冲液（裂解液配方：50 mmol／L Tris⁃HCl，pH＝7.5，1%NP⁃40，100 mmol／L NaCl，10%甘油，10 mmol／L MgCl 和蛋白酶抑制剂混合物），置于在冰上，40 min 后离心（离心半径 10 cm，12 000 r／min，10 min，4 ℃）。吸取上清液，取 100 μL 于另一 EP 管并加入蛋白上样缓冲液。剩余的裂解物加入20 μg GST⁃PAK⁃CRIB 结构域（PAK⁃CD）孵育 1 h（GST⁃PAK⁃CRIB 融合蛋白已偶联到谷胱甘肽琼脂糖珠）。用漂洗缓冲液漂洗沉淀复合物3 遍，离心（离心半径10 cm，5 000 r／min，5 min，4 ℃）去除漂洗液并加入蛋白上样缓冲液，95 ℃煮沸 10 min。

1.7 Western印迹法

将培养的心肌细胞用PBS 洗涤3 次。加入强RIPA 裂解液，置冰上30 min，然后转移至新的 EP管中离心10 min。取上清液，用BCA 蛋白检测试剂盒检测总蛋白，按比例加入蛋白上样缓冲液95 ℃煮沸 10 min。取 20 μg 蛋白进行 SDS⁃PAGE 电泳，然后将蛋白转移到PVDF 膜上。用5%的脱脂奶粉室温封闭 1 h，加入一抗（1 ∶1 000），4 ℃摇床孵育过夜，TBST 洗膜 3 次后加入 HRP 二抗（1 ∶1 000）室温摇床1 h，继续TBST 洗膜3 次，用化学发光成像分析仪对条带进行分析。

1.8 实时定量PCR

采用 TRIzol 试剂提取细胞的总 RNA，Primer⁃Script 一步法 RT⁃PCR 试剂盒反转录成 cDNA。利用SYBR Premix Dimmer Erase 试剂盒通过 qRT⁃PCR 扩增 cDNA。每个样本的基因表达用内参GAPDH 均一化。引物购自生物工程（上海）股份有限公司，见表2。以 2-ΔΔCt表示目的基因 mRNA 的相对表达水平。

1.9 基因微阵列分析

将 Ad⁃Vector、Ad⁃Rac1、Ad⁃Rac1⁃V12 共 3 种腺病毒转染 HEK293T 细胞。制备总 RNA，反转录，cDNA 标记，杂交，图像采集和分析由中国上海欧易生物公司进行。简而言之，是将cDNA 与荧光染料偶联并在4 次重复中与Prime View TM 人类基因表达阵列（Affymetrix，USA）杂交。使用 GeneSrping软件（版本 12.5；Agilent Technologies）的分位数算法对数据进行归一化。通过倍数变化（上调≥2.0，下调≤-2.0）以及P≤0.05 鉴定DEG。

表2 聚合酶链反应序列Tab.2 The sequence of polymerase chain reaction

1.10 统计学处理

应用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析。各计量资料进行正态性检验，非正态分布数据采用对数转换后符合正态分布，计量资料采用±s表示。两组间比较采用独立样本t检验。两组连续性变量比较采用Pearson 相关性分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 基因芯片结果分析

构建 Ad⁃Vector、Ad⁃Rac1、Ad⁃Rac1⁃V12 腺病毒并转染HEK293T 细胞，收集样本后验证3 种病毒转染效率。Ad⁃Rac1 组和 Ad⁃Rac1⁃V12 组均成功表达内源性和外源性Rac1 蛋白，见图1A。将HEK293T 细胞转染Rac1 腺病毒 3 组（Rac1⁃1、Rac1⁃2、Rac1⁃3） 和 转染Rac1⁃V12 腺病毒 3 组（V12⁃1、V12⁃2、V12⁃3）。采用基因芯片技术进行检测，筛选组间差异表达基因，筛选条件为Log2Fold change≥2.0，P＜0.05。基因芯片结果表明 Ad⁃Rac1⁃V12 组有 402 个相对于 Ad⁃Rac1 组的差异基因，其中 FGF13 上调（28±1.2）倍，见图1B。qRT⁃PCR 结果显示，与 Ad⁃Rac1 组相比，Ad⁃Rac1⁃V12 组FGF13 表达显著上调（P＜0.05），见图1C。

2.2 持续活化的Rac1促进心肌细胞FGF13的表达

为进一步探究被激活的 Rac1 与心肌细胞FGF13 表达量之间的关系，将心肌细胞分别转染Ad⁃Vector、Ad⁃Rac1、Ad⁃Rac1⁃V12 腺病毒 48 h，观察3 种腺病毒转染心肌细胞的效率，见图2A。Ad⁃Rac1 组和 Ad⁃Rac1⁃V12 组均成功表达外源性 Rac1蛋白，见图2B。GST pull down 实验结果表明，与Ad⁃Rac1 组相比，Ad⁃Rac1⁃V12 组 Active Rac1 的表达量显著上升（P＜0.05），表明 Ad⁃Rac1⁃V12 引起Rac1 持续性激活，见图2B。与 Ad⁃Rac1 组相比，Ad⁃Rac1⁃V12 组 FGF13 蛋白表达明显上调，心肌肥大标志基因 Anp、β⁃Mhc 表达显著增加（P＜0.05），见图2C、2D。

图1 过表达Rac1 和Rac1⁃V12 的差异表达基因Fig.1 Difference of gene expression between overexpression of Rac1 and Rac1⁃V12

2.3 下调FGF13减轻Rac1⁃V12介导的心肌细胞肥大

为进一步探究被激活的Rac1 调控FGF13 参与心肌细胞肥大的作用，构建 FGF13⁃siRNA 抑制FGF13 的表达（小干扰序列已在材料与方法中说明）。Western 印迹法检测3 组小干扰试剂的敲减效率，结果表明FGF13⁃si3 组的敲减效率最高（P＜0.05），见图3A、3B。因此，以下实验选择小干扰FGF13⁃si3 进行相关研究。与 Ad⁃Vector 组、 Ad⁃Rac1 组相比，Ad⁃Rac1⁃V12 组 Anp、β⁃Mhc 表达显著增高、心肌细胞表面积增大（P＜0.05）。而与Ad⁃Rac1⁃V12 组相比，Rac1⁃V12＋FGF13⁃si3 组 Anp、β⁃Mhc 表达降低、心肌细胞表面积减小（P＜0.05），表明下调 FGF13 减轻 Rac1⁃V12 介导的心肌细胞肥大，见图3C～3F。

图2 过表达 Rac1⁃V12 对心肌细胞 FGF13 的表达量及肥大基因的影响Fig.2 Effects of overexpression of Rac1⁃V12 on the expression of FGF13 and the hypertrophic gene in cardiomyocytes

图3 下调FGF13 减轻Rac1⁃V12 介导的心肌细胞肥大Fig.3 Down⁃regulation of FGF13 reduced Rac1⁃V12⁃induced cardiomyocyte hypertrophy

2.4 Ang Ⅱ通过激活Rac1上调FGF13表达

研究表明，Ang Ⅱ刺激下，Rac1 活性增强并促进心肌细胞肥大［3］。为探究 Ang Ⅱ激活 Rac1 与FGF13 之间的关系，将分离的乳鼠心肌细胞分3 组进行实验：生理盐水刺激 48 h；Ang Ⅱ（1 μmol／L）刺激 48 h；Ang Ⅱ（1 μmol／L）和 Rac1 特异性抑制剂 NSC23766（50 μmol／L）同时刺激 48 h。与对照组（生理盐水）相比，单独给予Ang Ⅱ刺激，心肌细胞表面积增大，Anp、β⁃Mhc、Active Rac1、FGF13 表达升高，与 Ang Ⅱ组相比，Ang Ⅱ＋NSC23766 组心肌细胞表面积减少，Anp、β⁃Mhc、Active Rac1、FGF13 表达下降（P＜0.05），见图4。

图4 Ang Ⅱ通过激活Rac1 继而促进FGF13 的表达Fig.4 Ang Ⅱ promoted the expression of FGF13 though activating Rac1

3 讨 论

病理性心肌肥厚是心源性猝死的重要且独立的危险因子［8⁃9］。因此，研究其潜在发生机制对寻找心肌肥厚的治疗靶点有着重要意义。Rac1 是小G 蛋白Rho 亚家族的成员之一，小G 蛋白与心肌肥厚密切相关［10⁃11］。生理状态下，Rac1 参与基因转录与周期调节等相关的细胞活动，这一过程受到严密调控，因此静息时心肌细胞内 Rac1 的活性水平低［12⁃13］。病理状态下，Rac1 活性显著增高，从而促进细胞生长、增殖与活性氧自由基产生，导致心肌肥厚的发生［14］。为了避开Rac1 在细胞内的复杂调节，一般使用Rac1⁃V12 这种具有持久活性的人工突变体来代表激活的Rac1。心脏特异性超表达Rac1⁃V12 的转基因小鼠出生后即表现为严重的心肌肥厚症状，继而心功能迅速失代偿，直至发展为充血性心力衰竭［15］。在他莫西芬诱导的心脏特异性Rac1 基因敲除小鼠中，因为Rac1 基因的缺失能够显著减轻Ang Ⅱ诱导的心室肥厚［16］。尽管在 AngⅡ刺激后 Rac1 被激活，但其下游促进心室肥厚的信号通路有很多，仍然有诸多机制不清楚。因此研究活性Rac1 促进心肌细胞肥大的机制并寻找相关治疗靶点具有重要意义。

表达谱芯片为寻找潜在的机制提供可能。为了进一步探究Rac1 被激活后导致心肌细胞肥大的机制，本研究成功构建了Rac1 人工突变体Rac1⁃V12腺病毒载体来模拟病理状态下Rac1 的持续激活状态，这比直接使用能够导致心肌肥厚的诸多刺激剂更为敏感及准确。通过基因芯片筛选工具细胞HEK293T 超表达 Rac1⁃V12 后上调的基因，发现FGF13 表达明显增高。研究证实，敲除FGF13 有利于减轻压力负荷增加介导的心室肥厚［6］。

本研究中，在体外实验中将 Ad⁃Rac1 和 Ad⁃Rac1⁃V12 转染原代大鼠心肌细胞。相较与 Ad⁃Rac1 组，Ad⁃Rac1⁃V12 组 FGF13 表达显著上调，这与HEK293T 细胞超表达 Rac1⁃V12 慢病毒得出的基因芯片结果一致。因此推测Rac1 的激活导致下游FGF13 的上调是一种普遍存在的细胞内机制。而在心肌细胞中FGF13 的上调可以通过细胞内机制，而非分泌到细胞外通过作用与自身的自分泌以及作用于边上心肌细胞的旁分泌的方式，导致心肌细胞肥大。本研究进一步通过Ang Ⅱ刺激心肌细胞增强Rac1 活性，发现 FGF13 表达量升高。AngⅡ刺激的同时使用 NSC23766 抑制 Rac1 活性，FGF13 表达下调。为进一步探究FGF13 的作用机制，体外实验转染Rac1⁃V12 病毒的同时加入siRNA下调FGF13，结果显示与超表达Rac1⁃V12 组相比，Rac1⁃V12＋FGF13⁃Si3 组 ANP、β⁃MHC 表达降低、心肌细胞面积减小。这些结果表明下调FGF13 可减轻Rac1 激活所引起的心肌细胞肥大。

综上，本研究阐述了Ang Ⅱ通过激活细胞内Rac1，继而上调FGF13，从而致心肌细胞肥大。本研究进一步完善了Ang Ⅱ通过激活Rac1 促进心肌肥大的机制，为临床防治心肌肥厚提供新的分子靶标。接下来，对激活的Rac1 是如何导致FGF13 上调的分子机制还需进一步研究。