广东甘薯疮痂病病原菌鉴定

于琳 佘小漫 蓝国兵 汤亚飞 李正刚 邓铭光 何自福

摘要：【目的】明确广东甘薯疮痂病的病原菌种类及生物学和系统发育学特征，为甘薯疮痂病防治及抗病育种提供参考。【方法】从广东省茂名和湛江等甘薯产区采集甘薯疮痂病植株，采用分生孢子悬液梯度稀释分离法分离病原菌，通过病原菌的形态特征观察、致病力测定，结合核糖体内转录间隔区（ITS）、28S核糖体RNA（LSU）、RNA聚合酶II第二大亚基（rpb2）和翻译延伸因子1-α（TEF1）部分序列的多核苷酸序列系统学分析等方法对病原菌进行鉴定。【结果】共分离获得26株单分生孢子分离物，随机选取3株代表性菌株SPEb-1、SPEb-2和SPEb-3进行观察和测定。光学显微镜下观察发现，3株代表性菌株的产孢细胞透明，内生芽殖;分生孢子单细胞，透明，短棒形，两侧顶端钝圆，大小为6.1～9.0 ?m×2.2～3.0 ?m;分生孢子梗短棒状;致病性人工接种表明，3株代表性菌株均可侵染甘薯引起典型的疮痂病症状。3株代表菌株的ITS、LSU、rpb2和TEF1序列与痂囊腔菌属（Elsino?）的E. ampelina、E. bidentis、E. arachidis、E. mimosae、E. ricini和E. sesseae等多个种的对应序列一致性为95%～99%。系统发育进化树分析结果显示，3株代表性菌株与蓖麻痂囊腔菌（E. ricini）單独聚成一支。【结论】广东甘薯疮痂病的病原菌为甘薯痂囊腔菌（E. batatas）。

关键词： 甘薯;疮痂病;鉴定;Elsino? batatas;系统发育分析;广东省

0 引言

【研究意义】甘薯是我国重要的粮食作物之一，甘薯疮痂病（Sweet potato scab）是甘薯生产上的一种毁灭性病害，是我国南方甘薯产区三大病害之一（黄实辉等，2011）。广东甘薯种植历史悠久，近年来种植面积达40万ha（刘翀等，2016），是我国南方最大的甘薯产区。广东湿润多雨的气候环境极易导致甘薯疮痂病的发生与流行，病害若在甘薯植株生长前期发生，产量损失可达30%～70%，造成严重的经济损失（黄实辉等，2011）。鉴于甘薯疮痂病对广东甘薯产业的严重危害，非常有必要对其病原菌进行鉴定，为生产上防治该病害提供科学依据。【前人研究进展】甘薯疮痂病具有悠久的流行历史，该病害呈世界性分布，在中国、美国、巴西、日本、马来西亚和斐济等国均有发生（Ames and OSullivan，2014）。Sawada（1931）首次报道1910—1928年我国台湾甘薯疮痂病的发生情况，鉴定病原菌的无性阶段形态特征，将病原菌的无性型命名为Sphaceloma batatas Sawada;随后Goto（1937）在日本发现甘薯发生疮痂病;Jenkins和Viégas（1943）鉴定了该病原菌的有性型，重命名为Elsino? batatas Viégas & Jenkins。韦修平（1959）最早记录我国大陆甘薯疮痂病的发生情况。国内外对甘薯疮痂病的研究主要集中在品种抗性鉴定、抗病育种和病害防治等方面（Smit et al.，1991; 黄实辉等，2011）。余文英等（2003，2005）研究了甘薯疮痂病菌侵染对甘薯活性氧代谢和细胞超微结构等的影响。方树民等（2004）筛选出甘薯疮痂病高抗品种广薯88-70和广薯111。陈胜勇等（2014）研究发现50%硫磺·多菌灵可湿性粉剂500倍液对甘薯疮痂病的防治效果最佳。Sumartini（2014）利用洋葱（Allium cepa L.）提取物作为生物杀菌剂处理甘薯植株，能使甘薯疮痂病病害强度降低70%～80%，使薯块的重量和大小增加46%，防止产量损失达33%。【本研究切入点】目前我国对甘薯疮痂病病原菌鉴定的研究较少，尚未发现对甘薯疮痂病菌病原菌生物学特征等方面的系统鉴定，并缺乏对该病菌分子系统学方面的研究。【拟解决的关键问题】通过病原菌的形态特征观察和致病力测定，结合核糖体内转录间隔区（ITS）、28S核糖体RNA（LSU）、RNA聚合酶II第二大亚基（rpb2）和翻译延伸因子1-α（TEF1）部分序列的多核苷酸序列系统学分析等方法，对源于广东的甘薯疮痂病病原菌进行鉴定，从而明确广东甘薯疮痂病的病原菌种类及生物学和系统发育学特征，为甘薯疮痂病防治及抗病育种提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 病害调查与样品采集

2017年10月—2018年2月，对广东省茂名和湛江等甘薯产区田间甘薯疮痂病发生情况进行调查。在茂名和湛江各调查2块田，采用五点取样法，每个点随机调查10株甘薯植株，计算甘薯疮痂病的发病率。采集典型发病植株装于牛皮纸信封中带回实验室分离备用。

1. 2 病原菌的分离与保存

在显微镜下观察病斑部位病原菌的形态，用灭菌刀片切取约0.5 cm×0.5 cm大小且含有大量分生孢子的病斑表皮组织，置于装有灭菌蒸馏水的1.5 mL离心管中，剧烈振荡1 min，配制病原菌分生孢子悬浮液。采用分生孢子悬浮液梯度稀释分离法（方中达，2007），吸取100 ?L稀释的分生孢子悬浮液均匀涂布于含0.03%乳酸的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上，晾干后用Parafilm封口膜封口，置于25 ℃恒温培养箱中培养7 d。挑取单一、粉红色、表面褶皱的圆形或不规则形菌落接种于PDA培养基上，获得纯化的病原菌培养物。将纯化的病原菌接种于SNA斜面培养基（1 L ddH2O中含1.0 g KH2PO4、1.0 g KNO3、0.5 g MgSO4·7H2O、0.5 g KCl、0.2 g葡萄糖、0.2 g蔗糖和15.0 g琼脂粉）上，在25 ℃恒温培养箱中培养30 d后，置于10 ℃培养箱中保存备用。

1. 3 病原菌形态观察

1. 3. 1 菌落形态观察和菌丝生长速度测定 选取在PDA培养基上培养20 d左右的代表性菌落，用直径为5 mm的打孔器在菌落边缘打取菌丝块，接种于新的PDA培养基上（培养皿直径为9 cm），用Parafilm封口膜封口后置于25 ℃恒温培养箱中黑暗培养，观察和记录菌落形态。每株菌株设3个重复。

1. 3. 2 产孢细胞形态观察和分生孢子大小测定

选取在25 ℃下PDA培养基上培养30 d的代表性菌落，用镊子夹取菌落表面气生菌丝，置于光学显微镜下观察产孢细胞和分生孢子形态。选取在25 ℃下PDA培养基上培养30 d的菌落，用接种针在菌落表面刮取气生菌丝置于装有1 mL无菌水的离心管中，配制成分生孢子悬浮液。在显微镜下随机选择5个视野（400×），每个视野随机选择10个分生孢子，共计50个分生孢子，测量分生孢子大小。

1. 3. 3 发病植株组织上病原菌的显微结构观察

采集病原菌分生孢子悬浮液接种21 d后具有典型病斑的甘薯叶片和茎秆，送至武汉塞维尔生物科技有限公司制作石蜡切片，经甲苯胺蓝染色后光学显微镜下观察病原菌的显微结构。

1. 4 病原菌致病性测定

1. 4. 1 活体植物接种 选取在PDA培养基上培养20 d左右的代表性菌落，用直径为5 mm的打孔器在菌落边缘打取菌丝块转接至100 mL马铃薯葡萄糖液体（PDB）培养基中，于25 ℃恒温摇床（150 r/min）中培养21 d后，即可产生大量分生孢子。用灭菌擦镜纸过滤去除菌丝，用血球计数板测定滤液中的分生孢子浓度，用PDB培养基调节分生孢子浓度为2×106个孢子/mL。使用喷壶（TaKaRa公司）將分生孢子悬浮液均匀喷洒至甘薯（品种：台湾番薯）植株上部的4～5片叶片、嫩梢和茎秆上，每株菌株接种4株甘薯植株，每株植株上接种30 mL分生孢子悬浮液，以接种等体积的PDB培养基为对照。将接种后的植株置于室外薄膜大棚内。接种期间棚内温度为20～25 ℃，定期喷水保持棚内空气相对湿度>80%，每日观察记录甘薯植株发病情况。试验重复2次。

1. 4. 2 甘薯块根接种 使用喷壶将浓度为2×106个孢子/mL的分生孢子悬浮液喷洒于甘薯薯块表面，以接种PDB培养基为对照，薯块晾干后，置于塑料盒中于25 ℃温室中保湿培养20 d，每日观察记录薯块发病情况。试验重复2次。

1. 5 ITS、LSU、rpb2和TEF1序列克隆与测序分析

选取在PDA培养基上培养20 d左右的代表性菌落，用直径为5 mm的打孔器在菌落边缘打取菌丝块，接种到100 mL的PDB培养基中，于25 ℃恒温摇床（150 r/min）中培养10 d后，用灭菌的定性滤纸过滤收集菌丝。菌丝经液氮研磨后，使用EasyPure? Plant Genomic DNA Kit（北京全式金生物技术有限公司）提取菌丝中基因组DNA，于-20 ℃保存备用。

分别使用引物对ITS1F/ITS4、LR0R/LR5、RPB2-5F2/fRPB2-7cR和elongation-1F/elongation-1R进行PCR，扩增ITS、LSU、rpb2和TEF1序列，引物（表1）委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系50 ?L：Premix TaqTM（TaKaRa公司） 25 ?L，基因组DNA 3 ?L，10 ?mol/L上、下游引物各3 ?L，ddH2O 16 ?L。扩增程序：95 ℃预变性2 min;95 ℃ 45 s，退火45 s（ITS和LSU，48 ℃;rpb2，56 ℃;TEF1，60 ℃），72 ℃ 1.5 min，进行35个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。将获得代表性菌株的ITS、LSU、rpb2和TEF1序列进行BLASTn同源性比对，将序列提交NCBI/GenBank获得基因登录号。

1. 6 病原菌系统发育进化分析

下载GenBank中已公布的痂囊腔菌属（Elsino?）代表性菌株的ITS、LSU、rpb2和TEF1序列（表2），利用ClustalW对各目的序列进行比对分析，通过手工校正序列，将校正后的上述4个序列按照首尾相连方法拼接后进行多重比对分析后，使用MEGA 5.2进行聚类分析。以Myriangium hispanicum为外群，采用最大似然法和T92+G+I模型，构建多基因系统发育进化树，以Bootstrap进行1000次重复检验，估算分支的自展支持率，分析其系统发育进化关系。

2 结果与分析

2. 1 甘薯疮痂病的危害与症状特点

在广东省湛江和茂名等地甘薯田间均发现甘薯疮痂病，田间发病率为20.0%～37.5%。当环境温度为20～30 ℃，湿润多雨条件下该病害极易暴发流行。该病主要为害甘薯的叶片、叶柄和茎秆，从植株顶端的嫩叶和茎秆处开始发病，发病初期叶片和茎秆上形成浅褐色小病斑，后期叶片上病斑呈棕褐色不规则形，零星分布，茎秆和叶脉上病斑呈棕褐色凹陷，病斑椭圆形、长椭圆形或不规则形，叶脉上的病斑可导致叶片呈“屈膝状”（图1）。

2. 2 病原菌的培养特性及形态特征

从采集的甘薯疮痂病病株样品中共分离获得26株单分生孢子分离物，在PDA培养基上25 ℃恒温培养，26株单分生孢子分离物的菌落形态相似，无明显差异。从中随机选取3株菌株SPEb-1、SPEb-2和SPEb-3作为代表性菌株，接种于PDA培养基上25 ℃恒温进行培养特性观察，结果显示，3株菌株菌丝生长极慢，培养30 d后，菌落均呈花瓣状、边缘不整齐，菌落呈棕红色，表面覆盖少量或大量白色绒毛状气生菌丝，气生菌丝致密，菌落直径约2.5 cm，菌落反面均可观察到棕红色色素;培养275 d后，菌落仍不能覆盖9 mm直径培养皿，菌落呈棕红色，表面覆盖红褐色或灰白色致密气生菌丝，产生大量橙红色色素分泌到菌落周围的培养基中，菌落反面可见棕红色色素，菌落下方培养基开裂（图2）。

在光学显微镜下观察SPEb-1、SPEb-2和SPEb-3菌株的显微结构，发现其产孢细胞透明，内生芽殖（图3-A和图3-B）;分生孢子单细胞，透明，短棒形，两侧顶端钝圆，大小为6.1～9.0 ?m×2.2～3.0 ?m，平均大小为7.4 ?m×2.6 ?m（图3-C）;发病植物组织处可见病原菌的分生孢子盘，内部着生分生孢子梗和分生孢子，分生孢子梗短棒状（图3-D），形态特征与Jenkins和Viegas（1943）描述的Sphaceloma batatas（E. batatas）基本一致。

2. 3 病原菌对甘薯的致病性测定结果

将3株代表性菌株SPEb-1、SPEb-2和SPEb-3的病原菌分生孢子悬浮液接种到甘薯植株9 d后，甘薯植株顶端叶片和茎秆上开始出现针尖大小的浅棕褐色小病斑（图4-A）。随着保湿培养时间的延长，病斑逐步擴大、融合。20 d后，在接种病原菌的甘薯植株上部叶片正面、背面叶脉及茎秆上均产生病斑，叶脉和叶柄上的病斑呈棕褐色的疣状疮痂，湿度大时疮痂呈红褐色（图4-B右）;叶片正面的病斑呈棕褐色圆形或多角形，病斑表面皱缩，周围叶片变黄（图4-D）;发病植株顶端嫩叶呈“屈膝状”（图4-C）。上述接种植株症状与田间症状表现一致。接种PDB培养基的对照植株健康生长，叶片和茎秆上未产生病斑（图4-B左）。病原菌分生孢子悬浮液接种甘薯薯块20 d后，薯块上未产生明显病斑。

2. 4 多基因核苷酸序列分析及同源性比对结果

为进一步明确广东甘薯疮痂病病原菌的分类地位，对3株代表性菌株SPEb-1、SPEb-2和SPEb-3进行ITS、LSU、rpb2和TEF1序列扩增和测序，分别获得长度为1010、878、910和389 bp的片段。BLASTn同源性比对分析结果表明，供试菌株的ITS、LSU、rpb2和TEF1序列与痂囊腔菌属（Elsino?）的E. ampelina、E. bidentis、E. arachidis、E. mimosae、E. ricini和E. sesseae等多个种的对应序列一致性为95%～99%，未比对出E. batatas的ITS、LSU、rpb2和TEF1序列。将SPEb-1、SPEb-2和SPEb-3菌株的ITS、LSU、rpb2和TEF1序列提交至GenBank（登录号见表2）。利用MEGA 5.2构建基于多个序列片段的系统发育进化树。聚类分析结果（图5）显示，分离菌株与蓖麻痂囊腔菌（E. ricini）单独聚成一支，其自展支持率为100%。

根据病原菌的形态和生物学特征及多核苷酸序列同源性比对结果，确定广东甘薯疮痂病的病原菌为甘薯痂囊腔菌（E. batatas）。

3 讨论

本研究通过对分离自广东省甘薯疮痂病植株的代表性菌落、分生孢子、产孢细胞、分生孢子梗和分生孢子盘的形态特征观察，采用柯赫氏法则进行验证，鉴定其属于痂囊腔菌属真菌;并通过多核苷酸序列分析及系统发育比对分析，鉴定出广东甘薯疮痂病的病原菌为甘薯痂囊腔菌（E. batatas）。

痂囊腔菌属[无性型为痂圆孢属（Sphaceloma）]真菌作为植物病原菌具有广泛的寄主范围和地理分布，能侵染许多重要的经济作物（柑橘和葡萄）、观赏植物（一品红）、大田作物（甘薯和大豆）和乔木（刺桐和欧洲榛），引起植物疮痂病（Fan et al.，2017）。甘薯痂囊腔菌为害甘薯植株时，不侵染甘薯块根，仅侵染甘薯地上部分的茎和叶片，在叶片正面、背面叶脉及茎秆上形成棕红色的病斑，发病后期叶片卷缩、畸形，叶柄弯曲，呈“屈膝状”，为害症状与前人研究报道（Sawada，1931;Goto，1937;Jenkins and Viégas，1943;黄实辉等，2011）一致。由于甘薯主要靠叶片进行光合营养积累，甘薯痂囊腔菌为害甘薯的茎和叶片，从而影响甘薯生长，造成减产。本研究明确了广东甘薯疮痂病的病原菌为甘薯痂囊腔菌，为甘薯疮痂病的防治提供了科学依据。

由于痂囊腔菌属真菌不同种间的菌落和分生孢子形态类似，需要结合形态学特征和分子生物学方法鉴定该属真菌的分类地位（Fan et al.，2017）。本研究利用多核苷酸序列系统分析甘薯疮痂病菌的ITS、LSU、rpb2和TEF1序列，经BLASTn比对发现上述序列与蓖麻痂囊腔菌下多个种的序列一致性为95%～99%，但NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中没有甘薯痂囊腔菌的任何基因信息。因此，本研究首次在NCBI数据库中提交了甘薯痂囊腔菌的遗传信息，通过系统发育分析发现甘薯痂囊腔菌与蓖麻痂囊腔菌的亲缘关系最近。本研究为NCBI数据库补充了甘薯痂囊腔菌的遗传信息，为甘薯疮痂病菌的鉴定提供重要参考依据。

刘奕君（2017）采用常规组织分离法从广西发生甘薯疮痂病典型症状叶片上分离获得的病原真菌接种甘薯未见疮痂病发病症状，未能分离到病原菌;此外，部分研究者发现通过常规组织分离法分离获得的病原真菌接种甘薯不发病（结果未发表），表明采用常规组织分离法难以分离获得甘薯痂囊腔菌。本研究发现，甘薯痂囊腔菌在PDA培养基上生长极其缓慢，在25 ℃下培养30 d后，菌落直径仅为2.5 cm;培养9个月，菌落仍不能覆盖直径9 cm的培养皿。该菌极慢的生长速度是导致无法通过常规组织分离法获得甘薯痂囊腔菌的原因。本研究通过普通光学显微镜及石蜡切片观察，发现甘薯疮痂病发病组织处产生大量的分生孢子，利用分生孢子悬浮液平板梯度稀释法获得大量甘薯痂囊腔菌的单分生孢子分离物。该方法操作简单，能快速、高效地分离获得发病甘薯组织处的痂囊腔菌属真菌，为甘薯疮痂病鉴定提供技术支撑。

4 结论

通过多核苷酸序列分析及同源性比对发现甘薯痂囊腔菌与蓖麻痂囊腔菌亲缘关系最近，明确广东甘薯疮痂病的病原菌为甘薯痂囊腔菌。本研究为NCBI数据库补充了甘薯痂囊腔菌的遗传信息，为甘薯疮痂病菌的鉴定提供重要参考依据。

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（責任编辑 麻小燕）