单链抗体JZC00联合2-脱氧葡萄糖的抗肿瘤活性

高 琪，韩 月，许 薇，徐静静，王 旻，张 娟

(中国药科大学生命科学与技术学院抗体工程实验室，南京 211198)

肿瘤比正常组织代谢更快[1]，因此肿瘤的发生与发展需要更多的营养物质，为了满足其需求，肿瘤在生长过程中会通过分泌细胞因子诱导血管新生[2-4]。临床数据证明，实体瘤生长过程中都伴有血管新生，即便在血液瘤患者的骨髓中也发现大量的新生微血管，证明血管生成对实体瘤和血液瘤的发展都有重要的作用，因此抑制肿瘤血管新生成为抗肿瘤的一个策略[5]。目前已上市的针对血管生成的单克隆抗体药物有靶向血管内皮生长因子(VEGF)的贝伐珠单抗及靶向血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)的雷莫卢单抗[6]，其中雷莫卢单抗能够阻断VEGF与VEGFR2结合，抑制VEGFR2的磷酸化，抑制下游信号通路，抑制肿瘤血管新生，从而发挥抗肿瘤效果[7]。但随着肿瘤的快速生长，肿瘤内部氧供应不足引起缺氧，进一步激活下游相关基因的表达，影响单抗药物对肿瘤生长的抑制作用，最后导致耐药性的产生[8]，如何提高缺氧环境下抗肿瘤血管生成抗体的药效，成为亟待解决的重要问题。

2-脱氧葡萄糖(2-deoxyglucose，2-DG)是一种人工合成的葡萄糖衍生物，50年代以来被广泛用于科研和临床研究[9]，其能够被葡萄糖转运体(GLUT)转移至细胞内，从而抑制细胞摄取葡萄糖。进入细胞后2-DG被己糖激酶磷酸化生成6-磷酸-2-DG，而6-磷酸-2-DG不能被进一步代谢，非竞争性地抑制己糖激酶，从而抑制糖酵解[10-11]。由于2-DG抑制了糖酵解的关键步骤，细胞糖酵解被抑制，导致ATP的产生减少，因此减缓细胞生长甚至导致细胞死亡[12-13]。近期有研究发现，2-DG能够抑制HIF-1α的表达，改善肿瘤缺氧微环境[14]。

JZC00是本实验室筛选得到的单链抗体，在前期的研究中发现其能够靶向VEGFR2，抑制VEGF与VEGFR2的结合，降低肿瘤血管密度，抑制肿瘤生长[15-16]。为了提高其活性，本研究选择了2-DG与JZC00联合使用，旨在探究JZC00与2-DG联用在体外对小鼠肿瘤细胞LLC及4T1的抑制作用，并且建立体内模型初步探究体内抗肿瘤效果。

1 材 料

1.1 试 剂

羟氨苄青霉素、硫酸链霉素(上海生物工程股份有限公司)；2-脱氧葡萄糖(2-DG，上海源叶生物科技有限公司)；His标签抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)；辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG (H+L) 、MTT粉末、蛋白Marker(上海翊圣生物科技有限公司)；乳酸测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；葡萄糖测定试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)；JZCOO由本实验室筛选构建，经摇瓶发酵并纯化得到。

1.2 细胞株

小鼠非小细胞肺癌细胞系LLC、鼠乳腺癌细胞系4T1购自中科院上海细胞所。

1.3 动 物

四周龄雌性C57BL/6J小鼠(合格证号：201918997)和四周龄雌性BALB/c小鼠(合格证号：201927296)均购自扬州大学比较医学中心。所有动物均自由进食水。动物实验符合动物伦理委员会标准。

2 方 法

2.1 细胞培养

LLC、4T1细胞均贴壁生长，采用含有10% FBS、0.1%氨苄青霉素、0.1%链霉素的DMEM完全培养基，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养，每2天传1代。

2.2 细胞增殖实验

将处于对数生长期的细胞消化后计数，按每孔2×103个细胞加入96孔板中，24 h后更换含有不同浓度药物的培养基，高低剂量组改变2-DG浓度，JZC00浓度不变，每个浓度设置3个复孔，继续培养72 h，用MTT法测定细胞增殖。每孔加入MTT 10 μL，混匀后置于37 ℃培养箱中孵育4 h，用酶标仪测定490 和630 nm处吸收度，绘制细胞增殖抑制曲线。计算公式：抑制率=(对照组吸收度-实验组吸收度)/(对照组吸收度-空白组吸收度)×100%。

2.3 葡萄糖摄取及乳酸释放速率测定实验

将处于对数生长期的细胞消化后计数，按每孔2×105个细胞加入6孔板中，过夜后更换含有不同浓度药物的培养基，培养48 h后收集上清液。葡萄糖浓度利用葡萄糖测定试剂盒检测。乳酸浓度利用乳酸测定试剂盒检测。乳酸释放抑制率计算公式：抑制率=[1-(实验组乳酸浓度/对照组乳酸浓度)]×100%；葡萄糖摄取抑制率计算公式：抑制率=[1-(实验组葡萄糖摄取率/对照组葡萄糖摄取率)]×100%。

2.4 蛋白免疫印迹

每个泳道中加入蛋白样品50 ng，80 V恒压30 min使样品完全浓缩，转换120 V恒压电泳1.5 h。电泳结束后，200 mA转膜100 min。转膜结束后用含有5%脱脂牛奶的TBS溶液37 ℃封闭2 h，封闭后鼠抗His标签一抗4 ℃孵育过夜。一抗孵育结束后，TBST洗膜3次，TBS洗膜3次，之后孵育二抗。孵育结束后TBST洗膜3次，TBS洗膜3次，凝胶成像系统成像并保存图片。

2.5 动物模型

LLC皮下移植瘤模型：小鼠适应环境1周后，将1×106个LLC细胞接种于C57BL/6J小鼠左侧皮下，待平均瘤体积达到100 mm3时，将荷瘤小鼠随机分为4组，每组5只：PBS对照组、JZC00单独用药组(5 mg/kg,iv,3次/周×2周)、JZC00与2-DG 低剂量联合用药组(JZC00:5 mg/kg,2-DG:200 mg/kg,iv,3次/周×2周)、JZC00与2-DG高剂量联合用药组(JZC00:5 mg/kg,2-DG:800 mg/kg,iv,3次/周×2周)。给药期间每两天测量一次瘤体积，利用公式V= LW2/2(L,肿瘤最长直径；W，垂直于L方向最长直径)。两周后处死小鼠，剥离瘤块用于后续分析。

4T1原位乳腺癌模型：小鼠适应环境1周后，麻醉小鼠将1×106个4T1细胞接种于BALB/c小鼠第4对乳腺脂肪垫内，待平均瘤体积达到100 mm3时，将荷瘤小鼠随机分为4组，分组、给药方式、给药剂量、分析方法同LLC皮下移植瘤模型。

2.6 数据分析

实验数据使用SPSS 22、GraphPad Prism 8.0进行分析，图中数据进行3次独立实验，不同组别间差异用t检验分析，P<0.05认为差异具有显著性。

3 结 果

3.1 单链抗体的表达纯化及鉴定

单链抗体JZC00由大肠埃希菌原核表达，利用镍柱纯化，将蛋白洗脱液制样SDS-PAGE检测，鉴定其纯度及相对分子质量。如图1-A所示，JZC00经镍柱纯化后相对分子质量约为28 kD，符合理论值，并且条带单一，达到电泳纯度。对蛋白洗脱液进行Western blot检测。如图1-B所示，在28 kD左右检测到条带与SDS-PAGE结果保持一致，证明大肠埃希菌表达的单链抗体正确，可用于后续活性的研究。

Figure1 Purification and identification of single-chain antibody JZC00

A：SDS-PAGE of JZC00 after purification of nickel column；B：Western blot result of JZC00

3.2 JZC00及2-DG对肿瘤细胞增殖的影响

首先研究了JZC00与2-DG对小鼠肿瘤细胞系LLC、4T1增殖的影响。如图2-A所示单链抗体JZC00对两株细胞的增殖都有较显著的抑制作用，且抑制作用呈剂量依赖性，JZC00浓度越高抑制作用越显著。图2-B显示2-DG也可有效抑制两株肿瘤细胞的增殖，随着浓度的升高2-DG对肿瘤增殖的抑制作用增强。

3.3 JZC00及2-DG对肿瘤细胞糖酵解的影响

在不同浓度药物作用48 h后，使用葡萄糖测定试剂盒及乳酸测定试剂盒检测上清液中葡萄糖和乳酸的浓度，探究JZC00和2-DG对肿瘤细胞糖酵解的影响。如图3所示，在体外常氧条件下，JZC00能够抑制肿瘤细胞的葡萄糖摄取速率及乳酸释放速率，证明JZC00能够抑制肿瘤细胞糖酵解。当JZC00与2-DG联合使用时，肿瘤细胞乳酸释放速率及葡萄糖摄取速率与2-DG单药组相比显著下降，证明JZC00与2-DG能够协同抑制肿瘤细胞糖酵解。在体内，肿瘤内部微环境中的氧含量显著低于正常组织，低氧环境下肿瘤组织中HIF-1α的含量升高，升高的HIF-1α激活下游相关基因的表达。抗血管生成药物在肿瘤缺氧条件下药效下降甚至产生耐药[2，17]，而2-DG可以在体内下调HIF-1α的含量[18]，因此猜测2-DG 在缺氧条件下可以恢复抗血管生成药物对于肿瘤生长的抑制作用。本研究选择了二甲氧乙二酰甘氨酸(DMOG)，它是HIF-1α脯氨酰羟化酶抑制剂，能够抑制HIF-1α的降解，因此通过DMOG可以在体外模拟HIF-1α高表达的缺氧环境。如图4所示在加入DMOG后，JZC00对于肿瘤细胞葡萄糖摄取及乳酸释放抑制能力显著下降。当加入2-DG后JZC00对肿瘤细胞糖酵解抑制能力恢复至常氧时的水平，说明HIF-1α会减弱JZC00对肿瘤细胞的抑制，但2-DG能够逆转HIF-1α对JZC00的抑制。

A:MTT assays of JZC00 on the inhibition of LLC and 4T1 cells;B:MTT assays of 2-DG on the inhibition of LLC and 4T1 cells

Figure3 JZC00 and 2-DG inhibit glycolysis in cancer cells

Figure4JZC00 and 2-DG inhibit glycolysis in cancer cells under hypoxia

3.4 单链抗体及2-DG的体内活性研究

前期的实验证明，JZC00及2-DG在体外能够抑制肿瘤细胞的糖酵解从而抑制其增殖，为了探究二者联合用药在体内实验中对肿瘤的抑制作用，构建了小鼠非小细胞肺癌皮下移植瘤模型及小鼠乳腺癌原位模型。给药2周后，处死小鼠剥离肿瘤组织进行分析。如图5-A、5-B所示，JZC00单独用药组、JZC00联合2-DG(200 mg/kg)组、JZC00联合2-DG(800 mg/kg)组均具有抗肿瘤活性，另外发现联合2-DG后JZC00的抑瘤效果显著提升。对剥离的肿瘤进行称重并计算抑瘤率。从图5-C、5-D发现联合用药低剂量组、联合用药高剂量组与对照组相比瘤重显著降低，且高剂量组药效提高最显著，抑瘤率达到75%。图5-E是各组小鼠给药期间体质量曲线，根据图中所示给药期间各组小鼠体质量变化无显著性差异，证明单链抗体JZC00及2-DG在产生抗肿瘤作用的同时对小鼠没有显著毒性。

A:Image of tumor mass peeled from different treatments after 15-day treatment;B:Tumor growth curve of each group under different treatment;C:Average tumor weight of different groups after 15-day treatment;D:Inhibition rate of different groups;E:The body weight curve of different group*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001.NS:no significance

2-DG联合JZC00在体外显著抑制肿瘤细胞LLC、4T1的糖酵解及增殖能力，同时在LLC皮下移植瘤模型中具有较好的抑瘤效果，因此建立了小鼠乳腺癌原位模型。如图6-A、6-B所示联合用药高剂量组相较于JZC00组、联合用药低剂量组有更优的抗肿瘤效果。图6-C、6-D所示联合用药组、JZC00组均显著降低了瘤重，且高剂量组药效提高最显著，抑瘤率达到了58%。并且根据图6-E所示，各组小鼠给药期间体质量无显著变化，显示联合用药对小鼠无显著毒性。

4 讨 论

肺癌和乳腺癌分别是中国男性和女性发病率最高的癌症，研究表明这两种肿瘤在生长过程中均会诱导血管新生，以满足其对氧和营养物质的需求,进而维持肿瘤生长。

本课题组在前期工作中得到了靶向VEGFR2的单链抗体JZC00，通过验证其能与VEGFR2结合，抑制肿瘤血管新生，具有较强的抑瘤作用。 2-DG是一种人工合成的糖酵解抑制剂，它在抑制肿瘤细胞糖酵解和肿瘤细胞生长的同时，还能在体内下调HIF-1α的表达[15，19]。肿瘤细胞的主要产能方式是糖酵解但其还会通过线粒体氧化磷酸化产生能量，因此在临床试验中2-DG单独使用疗效不显著。但本研究认为抑制肿瘤细胞糖酵解能够抑制肿瘤细胞的生长，同时能够下调HIF-1α的表达，下调相关基因的表达从而改善肿瘤微环境，提高抗体药物对肿瘤的抑制作用。基于此选择将JZC00与2-DG联合使用提高抗肿瘤活性。

Figure6 JZC00 and 2-DG demonstrateinvivoefficacy against 4T1 orthotopic model

A:Image of tumor mass peeled from different treatments after 19-day treatment;B:Tumor growth curve of each group under different treatment;C:Average tumor weight of different groups after 19-day treatment;D:Inhibition rate of different group;E:Body weight curve of different group

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.NS:no significance (n=5)

本实验通过大肠埃希菌发酵得到了单链抗体JZC00，利用MTT法分别检测了JZC00、2-DG对小鼠肿瘤细胞系LLC、4T1的增殖抑制活性。随后在体外常氧及体外模拟缺氧条件下测定乳酸释放速率、葡萄糖摄取速率，发现JZC00在HIF-1α高表达情况下抑制肿瘤细胞糖酵解能力下降，而2-DG可以逆转这一现象。选用C57BL/6J小鼠建立LLC皮下移植瘤模型、BALB/c小鼠建立4T1原位乳腺癌模型，以JZC00为对照初步验证了联合用药组的疗效，当2-DG达到临床给药剂量时，联合用药组抑瘤效果显著增强。JZC00与2-DG的联合使用通过抑制肿瘤血管新生及肿瘤细胞的糖酵解途径提高了JZC00的抑瘤效果。本文研究了JZC00与2-DG在常氧及诱导缺氧条件下对于肿瘤细胞糖酵解的抑制作用，但对于真正缺氧条件下的抑制作用未作研究，同时本实验对肿瘤细胞系进行了研究，但对于抗肿瘤血管生成抗体耐药细胞株还需下一步研究。