产谷氨酸脱羧酶重组枯草芽孢杆菌的构建与食品级表达

丁汪洋， 江 波， 沐万孟， 张 涛

（食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡，214122）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid， GABA）是一种含有4 个碳原子的非蛋白质氨基酸，作为一种抑制性神经递质广泛存在于哺乳动物中枢神经系统中[1]。 大量的研究表明，GABA 具有许多重要的生理功能，如利尿、调节血压、缓解精神焦虑、促进胰岛素的分泌等[2-5]。因此，GABA 可以做为一种功能性的成分应用于食品和药品领域[6]。

GABA 的制备方法有很多，如化学合成法、植物富集法、生物转化法。 其中由于生物转化法具有反应条件温和，对环境友好，生产成本低而具有很好的应用前景[7]。对于生物转化法制备GABA 主要是利用微生物表达的谷氨酸脱羧酶来催化底物谷氨酸或谷氨酸盐脱羧来实现， 其中应用最广泛的是利用乳酸菌发酵生产GABA，但利用乳酸菌发酵有菌体量少、培养条件苛刻、 谷氨酸脱羧酶表达量少等缺点， 使得GABA 的生产成本较高。 近年来，有研究者利用基因工程的手段使得谷氨酸脱羧酶在大肠杆菌中得到大量表达，但大肠杆菌是革兰氏阴性菌，其在发酵后期会产生内毒素，限制了其在食品工业上的应用[8]。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种国际上公认（generally recognized as safe，GRAS）的安全微生物[9]。 有少量报道用枯草芽孢杆菌作为宿主，实现了外源谷氨酸脱羧酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达[10-12]，但重组枯草芽孢杆菌在这些已有报道中表达的谷氨酸脱羧酶的酶活普遍不高。 此外，在重组菌培养的过程中需要添加抗生素筛选重组子和维持重组质粒的稳定性，无疑增加了生产成本和下游产物分离纯化难度，难以实现工业的要求。

本研究从实验室前期构建的无抗生素基因多拷贝表达载体和D-丙氨酸消旋酶（dal）缺陷型枯草芽孢杆菌[12]出发，将密码子优化前后的Lactococcus lactis ssp. lactisIL1403 谷氨酸脱羧酶基因与无抗生素抗性多拷贝表达载体相连，然后将重组质粒转入两种丙氨酸缺陷型的枯草芽孢杆菌感受态细胞中，构建了4 株无抗标记的重组枯草芽孢杆菌，首次实现了谷氨酸脱羧酶基因在枯草芽孢杆菌中的无抗高效表达。 通过筛选发酵酶活最高的重组菌株，并对初始发酵培养基成分进行调整，重组枯草芽孢杆菌在调整后的发酵培养基中发酵，发酵酶活最高可达7.4 U/mL，远远高于之前的有关报道，具有广泛的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌株和质粒 本研究用到的菌株和质粒见表1。

1.1.2 主要试剂、培养基和培养条件 GABA、谷氨酸标品：美国Sigma 公司；OPA 衍生化试剂、硼酸盐缓冲液 （pH 10.0）： 美国Agilent 公司； 引物合成、DNA 测序、质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒：上海生工生物工程公司；DNA Mark、PrimeSTAR 酶、标准相对分子质量蛋白质Mark：Takara 公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺：Bio-Rad 产品；其它试剂：购自国药集团。

表1 菌株与质粒Table 1 Strains and plasmids

液体LB 培养基（g/L）：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10；pH 7.0。

固体LB 培养基： 液体LB 培养基中加入2.0 g/dL的琼脂粉。

原始发酵培养基（g/L）：葡萄糖10，大豆蛋白胨20，K2HPO4·12 H2O 0.3；pH 7.0。 菌株B.subtilisWB600（dal-）、B.subtilis1A751（dal-）培养时需在培养基中加入终质量浓度为200 μg/mL D-丙氨酸。摇瓶发酵过程中发酵培养基的装液体积分数为20%，接种体积分数为1%，37 °C、200 r/min 的条件下培养。

1.1.3 主要仪器 PCR 扩增仪、 高速冷冻离心机：德国Eppendorf 公司产品；Agilent 1200 高效液相色谱仪：美国Agilent 公司产品；凝胶成像分析系统、垂直电泳仪：上海天能公司产品；恒温振荡培养箱：上海精宏公司产品； 紫外-可见分光光度计： 上海UNICO 仪器公司产品；超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技公司产品。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒的构建 在NCBI 数据库查找来源于Lactococcus lactisssp. lactis IL1403 的gadB基因序列（GeneBank NO:1114939），根据枯草芽孢杆菌的密码子偏好性委托上海捷瑞生物工程公司对GAD 基因做密码子优化。本实验所用到的引物由上海生工合成，引物序列见表2。

分 别 以pET-22b-gadB （ori）、pET-22b-gadB（opt） 为模板，P1/P2、P3/P4 为引物，PCR 扩增分别得到gadB（ori）、gadB（opt） 基因片段。 扩增条件为：98 ℃变性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸30 s，30 个循环。以pUB-P43-DPE-dal 为模板，以P5/P6、P7/P8为 引 物，PCR 分 别 扩 增 出 对 应 于gadB（ori）、gadB（opt）基因的PUB-P43-dal（ori）、PUB-P43-dal（opt）表达载体片段，扩增条件为：98 ℃变性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸1 min 20 s，30 个循环。 对4 种PCR 产物胶回收，然后参照文献[14]的方法用重叠延伸PCR 扩增得到两种PCR 多聚物， 重叠延伸PCR 条件为：98 ℃变性10 s，60 ℃退火5 s，72 ℃延伸1 min 45 s，30 个循环。 将两种PCR 多聚物分别转入枯草芽孢杆菌感受态细胞中，PCR 多聚物在枯草芽孢杆菌内源酶系统下进行重组得到重组表达质粒pUB-P43-gadB（ori）-dal、pUB-P43-gadB（opt）-dal。

表2 引物列表Table 2 List of primers

1.2.2 重组枯草芽孢杆菌的构建 采用两步（GMⅠ、GMⅡ）法[15]制作B.subtilisWB600（dal-）、B.subtilis1A751（dal-）感受态细胞，然后将两种PCR 多聚物分别转入B.subtilisWB600 （dal-）、B.subtilis1A751（dal-）感受态细胞中，在不添加D-丙氨酸的固体LB平板上分别筛选得到4 种重组菌B.subtilisWB600/pUB-P43-gadB （ori）-dal、B.subtilisWB600/ pUBP43-gadB（opt）-dal、B.subtilis1A751/ pUB-P43-gadB（ori）-dal、B.subtilis1A751/pUB-P43-gadB（opt）-dal。

1.2.3 目的蛋白质的纯化及SDS-PAGE 检测 目的基因在设计引物的时候添加了6 个组氨酸标签，重组蛋白质可以通过镍柱纯化出来。 重组菌超声破碎前先用终质量浓度为50 mg/mL 溶菌酶在37 °C 下反应30 min，具体纯化步骤参照文献[16]描述的方法进行。 利用粗酶液和纯化后的酶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，经考马斯亮蓝染色，脱色液脱色后在凝胶成像系统分析。

1.2.4 菌悬液的制备 将发酵液在4°C 于8 000 r/min离心10 min，弃清液，得到湿菌体。用0.1 mol/L、pH 4.5的醋酸盐缓冲液洗涤菌体两次，按照相同发酵液体积加入0.1 mol/L、pH 4.5 的醋酸盐缓冲液，反复吹打均匀制得菌悬液。

1.2.5 谷氨酸脱羧酶发酵酶活测定 1 mL 转化反应体系中含有800 μL 浓度为0.1 mol/L 的谷氨酸钠（溶解在0.1 mol/L 的醋酸钠缓冲溶液中，pH 4.5）、200 μL 菌悬液。转化体系在50 ℃的恒温水浴锅中反应10 min 后立即放入沸水中煮沸5 min， 终止其反应。转化体系经过灭酶后于12 000 r/min 离心10 min，取上清液，通过高效液相色谱计算转化液中GABA 含量。

酶活力单位定义:反应液中，每分钟催化底物生产1 μmoL GABA 所需要酶量为1 个酶活力单位（U）。

1.2.6 高效液相色谱检测 GABA 的检测采用OPA 在线衍生的方法： 取灭酶后的转化液于4 ℃、12 000 r/min 离心10 min， 上清液用5 g/dL TCA 稀释适当倍数后于4 ℃、12 000 r/min 离心10 min，取离心后的上清液过0.45 μm 的滤膜， 通过安捷伦1200 高效液相色谱仪检测转化液的GABA 浓度。色谱条件参照文献[17]的方法设定：色谱柱为Hypersil ODS 分析柱 （Agilent，4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流动相A （4.5 g/L 醋酸钠，200 μL/L 三乙胺，5 mL/L四氢呋喃，pH 7.2）、流动相B（22.6 g/L 醋酸钠，pH 7.2，甲醇∶乙腈以体积比1∶2 混合）；流速1 mL/min；进样体积1 μL；柱温40 ℃；DAD 紫外检测器，检测波长338 nm。

1.2.7 菌体生物量的测定 利用紫外-可见光分光光度计检测经适当稀释的菌液在600 nm 波长处的吸光度值，即OD600。

1.2.8 碳源对重组菌的生长和发酵酶活的影响 在原始发酵培养基其他成分不变的情况下研究不同碳源对生物量和发酵酶活的影响，确定最佳碳源后研究最佳碳源的质量浓度对重组菌生物量和发酵

酶活的影响。

1.2.9 氮源对重组菌生长和发酵酶活的影响 在优化好碳源的基础上研究不同氮源对生物量和发酵酶活的影响，确定最佳氮源后研究最佳氮源的质量浓度对重组菌生物量和发酵酶活的影响。

1.2.10 无机盐对重组菌生长和发酵酶活的影响在优化好碳氮源的基础上分别添加终质量浓度为100 mg/L 的MgSO4·7H2O、CaCl2、FeCl3·6H2O、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O，研究不同种类的无机盐对重组菌生物量和发酵酶活的影响。

2 结果与分析

2.1 4 种重组枯草芽孢杆菌的构建

PCR 扩增出的片段经琼脂糖电泳检测， 结果见图1。密码子优化前后gadB基因片段大小为1 401 bp、无抗表达载体pUB-P43-dal（抗性基因被D-丙氨酸消旋酶基因代替[13]）片段大小为3 847 bp、密码子优化前后的gadB基因与无抗表达载体通过重叠延伸PCR 形成的PCR 多聚物（相对分子质量很大，在泳道里）。 将两种多聚物分别转入两种丙氨酸缺陷型枯草芽孢杆菌WB600、1A751 中， 多聚物在枯草杆菌细胞中重组形成重组质粒pUB-P43-gadB （ori）-dal、pUB-P43-gadB（opt）-dal，大小为5 247 bp，得到4 株重组菌B.subtilisWB600/pUB-P43-gadB （ori）-dal、B.subtilisWB600/pUB-P43-gadB（opt）-dal、B.subtilis1A751/pUB-P43-gadB （ori）-dal、B.subtilis1A751/ pUB-P43-gadB（opt）-dal。 由于重组质粒上含有D-丙氨酸消旋酶基因，含有重组质粒的D-丙氨酸缺陷型枯草芽孢杆菌可以在不加D-丙氨酸的培养基上生长，以此筛选出重组子。

图1 基因片段PCR 扩增产物Fig. 1 PCR products of different genes

2.2 SDS-PAGE 分析

重组菌B.subtilis1A751/ pUB-P43-gadB（ori）-dal 在原始发酵培养基中培养30 h 后离心， 收集湿菌体，经超声破碎、离心后，得到上清液即为粗酶，上清液经镍柱纯化后得到纯化后的GAD。粗酶和纯酶经SDS-PAGE 检测见图2，大约在54 000 处有明显的蛋白质条带，与张天萌等[18]报道的一致，表明重组菌成功地表达了目的蛋白质。

图2 谷氨酸脱羧酶的SDS-PAGE 检测Fig. 2 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of GAD

2.3 4 种重组菌在原始发酵培养基中的发酵情况比较

从LB 平板上挑单菌落接种到LB 液体培养基中， 培养12 h 后按1%的接种体积分数接种到原始发酵培养基中， 隔一定时间取样测发酵液的OD600和发酵酶活，得到4 株重组菌的生长曲线和产酶曲线，见图3～4。 由图3 可知，4 株重组菌的生长量相差不大， 重组菌B.subtilisWB600/pUB-P43-gadB(ori)-dal、B.subtilisWB600/pUB-P43-gadB (opt)-dal的生物量略高于B.subtilis1A751/ pUB-P43-gadB(ori）-dal、B.subtilis1A751/ pUB-P43-gadB(opt)-dal。4 株重组菌的发酵酶活相差较大，说明GAD 的发酵酶活不仅跟宿主的类型有关，还跟目的基因密码子优化情况有关。 对于同种类型的宿主，GAD 基因通过密码子优化后重组菌的发酵酶活都得到了较大幅度的提升，对于同种类型的重组质粒，谷氨酸脱羧酶在宿主B.subtilisWB600 中表达比在宿主B.subtilis1A751 中表达更加高效。 原因可能是B.subtilisWB600 与B.subtilis1A751 相比，其敲除的蛋白质基因更多，可能会促使宿主将更多的能量用于表达外源基因。 最后选取酶活最高的B.subtilisWB600/pUB-P43-gadB（opt）-dal 做后续优化研究。

图4 4 株重组菌的发酵酶活曲线Fig. 4 GAD production curves of four recombinant strains

2.4 碳源对重组菌生长和发酵酶活的影响

图5 不同碳源对发酵酶活和生物量的影响Fig. 5 Effect of carbon source on GAD production and biomass

在原始发酵培养基的其他成分不变的情况下，分别以10.0 g/L 的葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、玉米糊精、可溶性淀粉作为碳源，在37 ℃、200 r/min的恒温振荡培养箱中培养42 h 后，取样测定不同碳源对发酵酶活和生物量的的影响，见图5。由图5 可知， 重组菌对麦芽糖的利用效果最好，OD600达到8.69，以蔗糖做为碳源，重组菌的发酵酶活最高，可达5.79 U/mL。 以蔗糖做为碳源，选取质量浓度5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 g/L 的蔗糖，研究不同蔗糖质量浓度对重组菌发酵酶活和生物量的影响，见图6。 结果表明， 重组菌的生物量随蔗糖质量浓度的增加会有小幅度的提升。 当蔗糖的质量浓度为10.0 g/L 时，重组菌的发酵酶活最大，达到4.0 U/mL。 蔗糖质量浓度超过10.0 g/L 时，重组菌的发酵酶活会逐渐降低。

图6 蔗糖添加量对发酵酶活和生物量的影响Fig. 6 Effect of sucrose concentration on GAD production and biomass

2.5 氮源对重组菌生长和发酵酶活的影响

图7 不同氮源对发酵酶活和生物量的影响Fig. 7 Effect of nitrogen source on GAD production and biomass

以10.0 g/L 的蔗糖作为碳源， 分别以20.0 g/L的胰蛋白胨、鱼粉蛋白胨、酵母膏、大豆蛋白胨、牛肉膏作为氮源，在37 ℃，200 r/min 的恒温振荡培养箱中培养42 h 后离心收集菌体，测定不同氮源对发酵酶活和生物量的影响，见图7。 结果表明，重组菌对酵母膏的利用效果最好，OD600可达到13.8， 以大豆蛋白胨做为氮源时重组菌产酶最多，发酵酶活可达5.06 U/mL。 以大豆蛋白胨作为氮源，选取质量浓度10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35 g/L 的大豆蛋白胨，研究不同大豆蛋白胨浓度对发酵酶活和菌体浓量的影响，见图8。 结果表明，当大豆蛋白胨质量的质量浓度为30.0 g/L 时， 重组菌的发酵酶活最高，达到7.02 U/mL。

图8 大豆蛋白胨质量浓度对发酵酶活和生物量的影响Fig. 8 Effect of soy peptone concentration on GAD production and biomass

2.6 无机盐对重组菌生长和发酵酶活的影响

无机盐对重组菌的生长繁殖与外源蛋白质的表达也有很大的联系。 在优化好的碳氮源的基础上， 分别添加终质量浓度为100 mg/L 的MgSO4·7H2O、CaCl2、FeCl3·6H2O、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O，在37 ℃、200 r/min 的恒温振荡培养箱中培养42 h后离心收集菌体，测定5 种无机盐对发酵酶活和生物量的影响，见图9。 对照组不加无机盐，其他条件保持一样。 结果发现对照组的OD600达到11.98，酶活达到7.4 U/mL，与对照组相比，无机盐的添加使重组菌的生物量和发酵酶都有一定程度的降低。

图9 无机盐种类对发酵酶活和生物量的影响Fig. 9 Effect of inorganic salt on GAD production and biomass

3 结 语

根据枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化了来源于Lactococcus lactis ssp. lactisIL1403 的谷氨酸脱羧酶基因，将优化前后的目的基因与无抗表达载体相连， 分别转入D-丙氨酸缺陷型的B.subtilisWB600（dal-）、B.subtilis1A751（dal-）感受态细胞中，得到4 种无抗标记的重组枯草芽孢杆菌，通过测定4 株重组枯草芽孢杆菌进行生长曲线和发酵酶活曲线，发现重组枯草芽孢杆菌中的发酵酶活不仅与目的基因密码子优化情况有关，还有宿主类型有关，目的基因经过密码子优化后在同一类型的宿主中的表达效率要大大高于优化前， 同一基因在B.subtilisWB600 中的表达效率要高于B.subtilis1A751。选择产酶效率最高的重组菌B.subtilisWB600/ pUBP43-gadB（opt）-dal，并调整了初始发酵培养基的成分，最终重组菌的发酵酶活可达7.4 U/mL，大大高于已报道谷氨酸脱羧酶在枯草芽孢杆菌中表达的最高酶活，具有很大的工业化全细胞生产食品级γ-氨基丁酸的潜力，有望解决在微生物法生产γ-氨基丁酸的工艺中大肠杆菌安全性的问题以及乳酸菌成本过高、产量低的问题。